2023, Vol. 54
中国海洋湖沼学会主办。
文章信息
- 陈强, 林毅, 黎中宝, 黄张帆, 孔鲁闽, 周思顺, 龙中英. 2023.
- CHEN Qiang, LIN Yi, LI Zhong-Bao, HUANG Zhang-Fan, KONG Lu-Min, ZHOU Si-Shun, LONG Zhong-Ying. 2023.
- pH胁迫对菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum) 耗氧率、排氨率、免疫和抗氧化酶活性以及组织形态的影响
- EFFECTS OF pH STRESS ON OXYGEN CONSUMPTION RATE, AMMONIA EXCRETION RATE, IMMUNE AND ANTIOXIDANT ENZYME ACTIVITY AND TISSUE MORPHOLOGY OF CLAM RUDITAPES PHILIPPINARUM
- 海洋与湖沼, 54(5): 1424-1433
- Oceanologia et Limnologia Sinica, 54(5): 1424-1433.
- http://dx.doi.org/10.11693/hyhz20230100013
文章历史
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收稿日期：2023-01-18
收修改稿日期：2023-04-25
2. 福建省海洋渔业资源与生态环境重点实验室 福建厦门 361021
2. Fujian Provincial Key Laboratory of Marine Fishery Resources and Eco-environment, Xiamen 361021, China
自工业革命后, CO2急剧增长的排放量已经大幅度超过了海洋碳循环的自我平衡调节能力(Sabine et al, 2004), 空气中近50%的CO2被海洋吸收, 严重破坏了海洋中的碳酸盐体系, 造成海洋酸化(Doney et al, 2009)。政府间气候变化专门委员会(Intergovernmental Panel on Climate Change, IPCC)预测在20世纪末海水pH由原本的8.1下降到7.8, 如果未控制CO2排放量, 到2300年pH可能持续下降0.8~0.9, 到2500年pH可能会下降到6.4~6.5 (Caldeira et al, 2003), 将严重影响海洋生态系统的平衡。为了控制CO2的增加, 国际上正在开展CO2封存技术(Carbon Capture and Storage, CCS) (Reguera et al, 2009), 而因为技术的发展不同, 在运输或封存过程中会导致CO2的泄漏, 这将会使周围海域的pH降低。有模拟实验表明CO2的泄漏会使海水pH急剧降低到5.6左右, 恢复过程中会在pH 6.4保持很长一段时间(Widdicombe et al, 2007)。近几年已经有较多海洋生物受到海洋酸化的影响: 如海水pH的降低使生物的耗氧率、排氨率降低(杨杰青等, 2016; 陆莉莉等, 2022), 海水酸化能通过干扰双壳动物的能量代谢途径来影响免疫功能(Bibby et al, 2008; Lannig et al, 2010), 海水酸化还是一种促氧化的胁迫源, 会影响海洋生物机体的氧化作用(Ricevuto et al, 2016; Nardi et al, 2017; Munari et al, 2018)。海水酸化已经严重影响到海洋生物的生活和生存环境, 也影响到了海洋经济发展。
贝类作为海洋碳循环的重要参与者, 对海洋环境的变化具有较强的适应性, 目前贝类是研究海洋和海岸生态系统的重要“模式生物”(Ji et al, 2006) (高山等, 2017; 王婷等, 2022), 能够作为海洋指示生物来反映海洋酸化的影响。菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)亦称马尼拉蛤仔、花蛤, 常栖息于潮间带或潮下带泥沙底部(庄启谦, 2001), 为我国四大养殖贝类之一, 是重要的经济物种之一。目前关于酸化对菲律宾蛤仔生理生化影响的研究较少, 本研究选择菲律宾蛤仔作为受试生物, 通过使用HCl调节海水pH (pH 6.4、7.1和7.7)探究菲律宾蛤仔生理生化的变化情况, 明确菲律宾蛤仔对海洋酸化的反应, 期望为菲律宾蛤仔的养殖管理提供可靠的数据, 为未来研究海洋酸化对海洋生物的影响提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 材料菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)购自厦门市高崎水产批发市场, 取活泼无损伤个体, 体型规格为: 壳长(3.3±0.2) cm, 壳宽(2.1±0.1) cm, 壳高(1.8±0.2) cm, 体重(8.5±0.5) g。试验开始前蛤仔均在水箱中暂养1周, 暂养期间保持连续充气, 每日投喂足量小球藻(Chlorella sp.), 投喂1 h后100%换水1次, 暂养温度(25±1) ℃, 盐度31±2, pH 8.0±0.1 (正常海水pH)。试验期间所用海水均为海水晶配置海水, 海水晶均购买自浙江蓝海星盐制品有限公司, 是以天然海盐经过添加少量Mg、K、Ca、Zn、Se、Mo等微量元素研制而成。
1.2 试验设计 1.2.1 生理试验设计试验采用静水密封的方法, 设置pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0共5个梯度, 每个梯度设3个重复, 1个空白对照, 以pH 8.0组为对照组; 通过滴加NaOH和HCl调节海水pH, 稳定后挑选90个健康、规格一致的蛤仔, 随机放置到1.1 L的PE广口塑料瓶中, 待蛤仔伸出水管6 h后测量水体溶解氧和氨氮浓度。
1.2.2 生化试验设计本试验设置4个pH梯度, 对照组(pH 8.0±0.1), 6.4组(pH 6.4±0.1), 7.1组(pH 7.1±0.1), 7.7组(pH 7.7±0.1), 每组3个重复; 酸化组通过滴加1 mol/L HCl降低水体pH。菲律宾蛤仔暂养驯化一周后挑选600个健康无损害, 规格一致个体, 随机放置到12个水缸中, 每缸蛤仔数量为50, 实验共进行42 d, 每天投喂足量小球藻, 投喂1 h后吸污换水1/3, 试验在第14、28和42天采样。
1.2.3 采样与样品制备用已灭菌剪刀和镊子在冰盒中快速取每个菲律宾蛤仔的内脏团和鳃组织, 用预冷的生理盐水(0.9%)冲洗, 滤纸吸干水分, 每组重复分别取6个菲律宾蛤仔组织, 每个组织用分析天平称重0.2~1.0 g分装到2个离心管中, 每个离心管中含有3个蛤仔的相同组织(进行混样), 加入9倍体积的0.9%生理盐水, 用组织研磨器低温下研磨。低温高速离心机4 ℃下3 000 r/min, 离心10 min取上清液测酶活性。此外, 每组重复取3个蛤仔的鳃组织放置于4%多聚甲醛溶液中固定, 用于组织形态观察分析。
1.3 计算方法
(1)式中, OR为单位菲律宾蛤仔干重耗氧率[单位: mg/(g·h)], DO0、DOt分别为实验开始和实验结束时实验水体中溶解氧含量(单位: mg/L), V为实验PE广口塑料瓶中所用水的体积(单位: L), W为实验蛤仔软组织干重(单位: g), t为实验持续的时间(单位: h)。
(2)式中, NR为单位蛤仔干重排氨率[单位: mg/(g·h)], Nt、N0为实验结束时和实验开始水中氨氮的浓度(单位: mg/L), V为实验PE广口塑料瓶中所用水体积(单位: L), W为实验蛤仔软组织干重(单位: g), t为实验持续的时间(单位: h)。
1.4 指标测定酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性使用南京建成试剂盒(微量酶标法)检测, 利用酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物的原理, 在酶标仪520 nm测定吸光度后可计算酶活性。
溶菌酶(LZM)活性使用南京建成试剂盒(比浊法)检测, 因为溶菌酶能水解细菌细胞壁上肽聚糖使细菌裂解而浓度降低, 透光度增强, 使用分光光度计透光度值计算溶菌酶活性。
总抗氧化能力(T-AOC)通过南京建成试剂盒(ABTS法)检测, 利用ABTS会被氧化剂氧化成显色的ABTS+, 使用酶标仪测出ABTS+吸光度即可计算样品抗氧化能力。
过氧化氢酶(CAT)活性通过南京建成试剂盒(钼酸铵法)检测。利用钼酸铵与H2O2产生黄色络合物, 使用分光光度计测出的吸光度值计算出过氧化氢酶活性。
超氧化物歧化酶(SOD)活性通过南京建成试剂盒(WST-1法)检测, 丙二醛(MDA)含量通过南京建成试剂盒(TBA法)检测。
1.5 切片制作将取好的组织样品迅速裁成规定大小后放入多聚甲苯中, 固定24 h; 用水和70%的乙醇将固定液洗去, 水洗后将上述组织依次浸入75%乙醇/1 h, 95%乙醇/30 min, 100%乙醇/30 min, 进行脱水; 脱水后将组织浸蜡和包埋, 室温冷却后进行切片后使用苏木精伊红染色。
1.6 数据分析试验数据于EXCEL中进行初步处理统计, 之后使用SPSS 19.0软件进行方差分析。运用Duncan test对数据进行显著性检验, 显著性水平为0.05。试验数据以平均值±标准误表示。
2 结果 2.1 pH对菲律宾蛤仔生理指标的影响 2.1.1 pH对菲律宾蛤仔耗氧率的影响pH对菲律宾蛤仔耗氧率的影响见图 1。由图 1可知, pH 5.0~8.0时耗氧率呈上升趋势, pH 8.0~9.0时耗氧率呈下降趋势, 在pH 8.0时达到顶峰为0.34 mg/(g·h), 显著高于pH 5.0、6.0、7.0、9.0 (P < 0.05)。
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| 图 1 pH对菲律宾蛤仔耗氧率的影响 Fig. 1 Effect of pH on oxygen consumption rate of R. philippinarum |
pH对菲律宾蛤仔排氨率的影响见图 2。由图 2可知, pH 5.0~8.0时耗氧率呈上升趋势, pH 8.0~9.0时耗氧率呈下降趋势, 当pH为8.0时, 排氨率达到峰值为0.071 mg/(g·h), 显著高于pH 5.0、6.0、7.0、9.0 (P < 0.05)。
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| 图 2 pH对菲律宾蛤仔排氨率的影响 Fig. 2 Effect of pH on ammonia excretion rate of R. philippinarum |
经过石蜡切片以及H.E染色, 观察经过42 d pH胁迫菲律宾蛤仔的鳃组织的主要结构发现: 对照组的鳃丝较为正常(图 3a, 箭头所示); 7.7组的鳃丝间距扩大, 鳃丝间的空腔变大(图 3b, 箭头所示); 7.1组相对对照组鳃丝间距扩大(图 3c, 箭头所示); 6.4组的鳃丝不规则变形, 间距更大, 鳃上皮细胞损伤, 鳃丝纤毛排列紊乱黏合(图 3d, 箭头所示)。
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| 图 3 pH对菲律宾蛤仔鳃组织结构的影响 Fig. 3 Effects of pH on the tissue structure of R. philippinarum 注: a. 对照组; b. 7.7酸化组; c. 7.1酸化组; d. 6.4酸化组 |
由图 4可得, 鳃组织中的溶菌酶(LZM)活性趋势为先升后降, 第14天酸化组显著低于对照组(P < 0.05), 6.4组显著低于其他酸化组(P < 0.05), 7.1组显著低于7.7组(P < 0.05); 第28、42天6.4组显著低于其他组(P < 0.05), 7.1与7.7组间无差异性, 皆显著低于对照组(P < 0.05)。
酸性磷酸酶(ACP)活性趋势各组不相同; 第14天6.4组显著高于其他组(P < 0.05), 7.1组显著低于7.7组和对照组(P < 0.05), 7.7组显著低于对照组(P < 0.05); 第28天6.4与7.1组无差异性, 皆显著低于7.7和对照组(P < 0.05), 7.7组显著低于对照组(P < 0.05); 第42天6.4组显著低于其他组(P < 0.05), 7.1与7.7组无差异性, 皆显著低于对照组(P < 0.05)。
碱性磷酸酶(AKP)活性趋势各组不相同; 第14天6.4组显著高于其他酸化组(P < 0.05), 与对照组无差异性, 7.1与7.7组无差异性, 皆显著低于对照组(P < 0.05); 第28天6.4、7.1和对照组无差异性, 皆显著低于7.7组(P < 0.05); 第42天6.4组显著高于7.1和对照组(P < 0.05), 显著低于7.7组(P < 0.05), 7.1组显著高于对照组且显著低于7.7组(P < 0.05), 7.7组显著高于对照组(P < 0.05)。
2.3.2 pH对菲律宾蛤仔内脏团免疫酶活性的影响由图 5可得, 内脏团LZM活性变化趋势为先升后降; 第14天6.4组显著高于7.1组(P < 0.05), 显著低于7.7和对照组(P < 0.05), 7.1组显著低于7.7和对照组(P < 0.05), 7.7组显著低于对照组(P < 0.05); 第28天6.4组显著高于7.1和对照组(P < 0.05), 显著低于7.7组(P < 0.05), 7.1组显著低于7.7组(P < 0.05), 显著高于对照组(P < 0.05), 7.7组显著高于对照组(P < 0.05); 第42天6.4组显著低于其他酸化组(P < 0.05), 与对照组无差异性, 7.1与7.7组无差异性。
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| 图 5 pH对菲律宾蛤仔内脏团免疫酶活性的影响 Fig. 5 Effect of pH on immune enzyme activity in visceral mass of R. philippinarum |
ACP活性变化趋势为先升后降; 第14天6.4与7.1组无差异性, 显著高于7.7组和对照组(P < 0.05), 7.7与对照组无差异性; 第28天6.4组显著高于其他组(P < 0.05), 7.1与7.7组无差异性, 皆显著高于对照组(P < 0.05); 第42天各组间无差异性。
AKP活性变化趋势为持续下降; 第14、28天6.4组与7.1组无差异性, 显著低于7.7组(P < 0.05), 显著高于对照组(P < 0.05), 7.7组显著高于对照组(P < 0.05); 第42天各组间无差异性。
2.3.3 pH对菲律宾蛤仔鳃抗氧化酶活性的影响由图 6可得, 超氧化物歧化酶(SOD)活性变化趋势持续上升; 第14天6.4组与7.7组无差异性, 显著高于7.1组(P < 0.05), 显著低于对照组(P < 0.05), 7.1组显著低于对照组(P < 0.05); 第28天6.4组显著低于其他组(P < 0.05), 7.1组与对照组无差异性, 显著低于7.7组(P < 0.05); 第42天6.4组和7.1组与对照组无差异性, 皆显著低于7.7组(P < 0.05)。
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| 图 6 pH对菲律宾蛤仔鳃组织抗氧化酶活性的影响 Fig. 6 Effect of pH on antioxidant enzyme activity in gill of R. philippinarum |
过氧化氢酶(CAT)活性变化趋势各组不相同; 第14天6.4组显著高于7.1组(P < 0.05), 显著低于7.7和对照组(P < 0.05), 7.1组显著低于其他组(P < 0.05), 7.7组显著高于其他酸化组(P < 0.05), 显著低于对照组(P < 0.05); 第28天6.4与7.1组无差异性, 皆显著低于7.7和对照组(P < 0.05), 7.7与对照组间无差异性; 第42天6.4与7.1组无差异性, 皆显著低于7.7组(P < 0.05), 显著高于对照组(P < 0.05), 7.7组显著高于对照组(P < 0.05)。
总抗氧化能力(T-AOC)变化趋势各组不相同; 第14天6.4组显著低于其他组(P < 0.05), 7.1组显著高于对照组(P < 0.05), 显著低于7.7组(P < 0.05), 7.7组显著高于对照组(P < 0.05); 第28天6.4组显著低于其他组(P < 0.05), 7.1与对照组无差异性, 皆显著低于7.7组(P < 0.05); 第42天6.4与7.1组无差异性, 皆显著低于7.7组(P < 0.05), 显著高于对照组(P < 0.05), 7.7组显著高于对照组(P < 0.05)。
丙二醛(MDA)含量变化趋势各组不相同; 第14天各组间无差异性; 第28天6.4组显著高于7.1组(P < 0.05), 显著低于7.7和对照组(P < 0.05), 7.1组显著低于其他组(P < 0.05), 7.7与对照组无差异性; 第42天酸化组间无差异性, 皆显著低于对照组(P < 0.05)。
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性变化趋势为持续上升; 第14天6.4组显著高于7.1组(P < 0.05), 显著低于7.7和对照组(P < 0.05), 7.1组显著低于其他组(P < 0.05), 7.7组与对照组无差异性; 第28、42天6.4组显著低于其他组(P < 0.05), 7.1组与对照组无差异性, 皆显著低于7.7组(P < 0.05)。
2.3.4 pH对菲律宾蛤仔内脏团抗氧化酶活性的影响由图 7可得, 内脏团组织SOD活性变化趋势为持续下降; 第14、42天6.4组显著高于其他组(P < 0.05), 7.1与7.7组无差异性, 皆显著高于对照组(P < 0.05); 第28天6.4组显著高于其他组(P < 0.05), 7.1、7.7组和对照组无差异性。
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| 图 7 pH对菲律宾蛤仔内脏团抗氧化酶活性的影响 Fig. 7 Effect of pH on antioxidant enzyme activity in visceral mass of R. philippinarum |
CAT活性变化趋势呈下降趋势; 第14天6.4组显著高于其他组(P < 0.05), 7.1与7.7组无差异性, 皆显著高于对照组(P < 0.05); 第28天6.4组显著高于其他组(P < 0.05), 7.1、7.7组和对照组无差异性; 第42天各组间无差异性。
T-AOC变化趋势各组不相同; 第14天酸化组间无差异性, 显著高于对照组(P < 0.05); 第28天6.4组显著高于其他组(P < 0.05), 7.1组显著高于7.7与对照组(P < 0.05), 7.7与对照组间无差异性; 第42天6.4组显著低于其他酸化组(P < 0.05), 显著高于对照组(P < 0.05), 7.1组显著高于7.7组(P < 0.05), 7.7组显著高于对照组(P < 0.05)。
MDA含量变化趋势为持续下降; 第14天6.4组显著低于7.1组(P < 0.05), 显著高于7.7和对照组(P < 0.05), 7.7与对照组无差异性; 第28天酸化组间无差异性, 皆显著高于对照组(P < 0.05); 第42天6.4组显著高于其他酸化组(P < 0.05), 与对照组无差异性, 7.1组与7.7组无差异性, 皆显著低于对照组(P < 0.05)。GSH-Px活性变化趋势为先升后降; 第14、42天各组间无差异性; 第28天6.4组显著高于其他组(P < 0.05), 7.1与7.7组无差异性, 皆显著高于对照组(P < 0.05)。
3 讨论耗氧率和排氨率是研究贝类基础新陈代谢的重要内容之一, 能够为水产养殖和生态学研究提供基础性的资料, 已知有多种环境因素能够影响新陈代谢的过程。已有多项研究各种因素影响滤食性贝类耗氧率和排氨率的影响(胥贤等, 2015; 刘傲东等, 2016; 王静等, 2019; 卢王梯等, 2020; 江天棋等, 2020), 但是并未发现有关于pH对菲律宾蛤仔耗氧率和排氨率影响的研究。pH的升高或降低都有可能会导致蛤仔组织的损伤从而影响了生理代谢; 黑唇鲍(Haliotis rubra) (Harris et al, 1999)、长肋日月贝(Amusium pleuronectes) (严俊贤等, 2018)和东方小藤壶(Chthamalus challengeri) (曹善茂等, 2013)在低pH时的耗氧率和排氨率低, 本文中当pH低于8.0时, 耗氧率和排氨率随之降低, 说明低pH不利于贝类的呼吸代谢; 本研究蛤仔的耗氧率和排氨率在pH 8.0时达到顶峰, 一般贝类的耗氧率和排氨率在8.0~8.5时出现最大值, 如尖紫蛤(Soletellina acuta) (黄洋等, 2013)在pH 8.4时达到最大值、合浦珠母贝(Pinctada fucata) (刘建业等, 2011)的最大值在pH 8.0时出现; 当pH过高时, 贝类的生理活动也会受到影响, 当pH 9.0时耗氧率和排氨率呈显著下降的趋势。说明贝类的生理活动与pH的变化息息相关。
免疫防御和抗氧化防御系统是软体动物防御系统的一部分。免疫防御分为细胞免疫和体液免疫(Loker et al, 2004), 细胞免疫主要依赖血细胞的吞噬作用, 体液免疫主要依靠凝集素、溶血素、溶酶体酶和酚氧化酶等各种非特异性的酶和免疫因子的共同作用(刘志鸿等, 2003)。酸性磷酸酶和碱性磷酸酶是溶酶体的重要的组成部分, 在酸性环境下, ACP进行水解作用, 把表面带有磷酸酯的异物水解掉, 防止机体受到感染(Cheng, 1978); AKP调节膜运输, 参与转磷酸作用, 促进体内的钙磷代谢, 维持体内适宜的钙磷比例(Beedham, 1958; 郑艺杰, 2006)。在李晓梅等(2016)的研究中发现近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)鳃组织中的LZM活性会随着pH的降低而降低; 在梁健等(2017)的研究中发现青蛤(Cyclina sinensis)的LZM活性随着时间呈先升后降的趋势。本研究中内脏团中ACP和AKP活性相对高于鳃组织, 可以猜测内脏团是机体防御免疫的主要场所; 在42 d的胁迫中, 免疫酶活性趋势为先上升后下降, 推测可能是由于前期的胁迫导致蛤仔产生应激反应, 从而产生大量的酶来抵御环境的变化; 第42天免疫酶活性下降, 说明蛤仔对环境已经趋于适应, 但在42 d的pH胁迫后蛤仔组织已经损伤了, 酶活性不能恢复到原有水平。
抗氧化防御系统是应对环境污染胁迫做出快速响应的一类物质总称, 主要包括非酶类抗氧化剂和酶类抗氧化剂(蒋国萍, 2016)。在贝类的防御系统中, 酶类抗氧化剂起着不断清除活性氧以维持机体活性氧动态平衡的作用。环境因子的胁迫可能会导致机体组织器官受损产生大量的活性氧(谭志军, 2006), 导致机体产生过氧反应, 严重可能会导致细胞坏死。在Wang等(2016)的研究中发现经过28 d的酸化胁迫后酸化组鳃组织中的抗氧化酶活性低于对照组; 马广智等(2001)的研究中发现在草鱼(Ctenopharyngodon idella)在酸化条件下SOD的活性随着酸化时间的延长而降低; 通过Matozzo等(2013)的研究发现在低pH时鸡帘蛤(Chamelea gallina)鳃组织中SOD和CAT的活性高于对照组; 但在本研究中第14天鳃组织中SOD和CAT活性均低于对照组。鳃组织的CAT和SOD的活性均为先降后升, 说明在前期酸化组所设pH能够抑制这两种酶类的分泌, 但是在经过长期的胁迫后组织可能出现了损伤导致这两种酶活性的升高。在内脏团中, 这两种酶类的活性为下降趋势, 说明pH降低抑制内脏团中这两种酶的释放。
谷胱甘肽过氧化物酶作为抗氧化系统中非酶类抗氧化剂的组成部分, 能够清除动物机体内过氧化产物, 保证细胞膜结构和功能的完整性(Wang et al, 2008; Pacitti et al, 2013), 维持机体内的正常氧化还原反应(Hussain et al, 2004)。在彭玲等(2015)的研究中发现, 厚壳贻贝(Mytilus coruscus)在不同浓度Cd的胁迫下GSH-Px的活性为先升后降的趋势; 在邓思平等(2012)和于庆云等(2013)的研究中也体现了尖紫蛤和菲律宾蛤仔在重金属的胁迫下GSH-Px的活性为先升后降的趋势; 这都与本文的研究成果相似。说明在机体受到外界的胁迫时主要依靠GSH-Px来清除体内的自由基, 使机体内环境保持平衡。
4 结论(1) pH的变化对菲律宾蛤仔的生理活动有着较大影响, 蛤仔的排氨率和耗氧率随着pH升高先增后降, 均在pH 8.0时达到最大值。
(2) 菲律宾蛤仔在经过42 d的pH胁迫后, 其鳃组织在不同的酸化组中出现了不同程度的组织损伤, 在6.4酸化组中组织损伤得更加严重。
(3) 在鳃组织中低pH对免疫和抗氧化酶活性有较为明显的抑制作用; 而且随着胁迫时间的增加, 原有的代谢水平被打破, 虽然蛤仔经过较长时间的适应后, 其酶活性水平有所回升, 但仍达不到原有的水平。另外, 长时间的酸化胁迫还可能使蛤仔的抗病力降低, 使其更容易死亡。
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