2023, Vol. 54
中国海洋湖沼学会主办。
文章信息
- 胡晨馨, 吕丽媛, 孙改改, 姚韩韩, 林志华, 董迎辉. 2023.
- HU Chen-Xin, LYU Li-Yuan, SUN Gai-Gai, YAO Han-Han, LIN Zhi-Hua, DONG Ying-Hui. 2023.
- 缢蛏(Sinonovacula constricta)耐氨氮关联SNP验证及相关基因NKA在氨氮胁迫下的表达特征分析
- VERIFICATION OF SNP ASSOCIATED WITH AMMONIA TOLERANCE AND EXPRESSION OF SNP-RELATED NKA GENE RESPONDING TO AMMONIA STRESS IN RAZOR CLAM (SINONOVACULA CONSTRICTA)
- 海洋与湖沼, 54(5): 1413-1423
- Oceanologia et Limnologia Sinica, 54(5): 1413-1423.
- http://dx.doi.org/10.11693/hyhz20230200033
文章历史
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收稿日期：2023-02-15
收修改稿日期：2023-04-20
2. 浙江万里学院宁海海洋生物种业研究院 浙江宁波 315604;
3. 宁波大学海洋学院 浙江宁波 315832
2. Ninghai Marine Biological Seed Industry Research Institute, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315604, China;
3. College of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315832, China
氨氮是水环境中常见的非生物胁迫因子之一, 当水生动物体内氨氮积累到一定程度时会导致组织受损和退化、离子调节失衡、氧化应激、炎症反应、生长减缓和高死亡率(Ren et al, 2014; Cheng et al, 2015; Zhang et al, 2018)。水环境中的氨氮主要有离子态氨(NH4+)和非离子态氨(NH3)两种形式, 二者可以相互转化, 并处于动态平衡, 机体内的氨氮大多以NH4+的形式存在(付莹等, 2018)。由于NH4+脂溶性极低且可与水结合形成水合离子, 不易透过细胞膜, 因此水生动物机体内的大多数氨氮的跨膜运输是通过各种转运蛋白来实现的(Weiner et al, 2019)。细胞外的氨氮主要通过铵转运体(AMT)和Rhesus (Rh)糖蛋白促进扩散, 也可由K+转运蛋白如Na+/K+-ATP酶(NKA)、Na+-K+-2Cl共转运蛋白(NKCC)和K+通道蛋白(KCN)等进行跨膜运输(Tresguerres et al, 2020)。有研究表明, 钠氢交换蛋白(NHE)、囊泡相关蛋白(VAMP)以及水通道蛋白(AQP)家族的某些成员也可能参与氨的跨膜转运(Walker, 2014)。总之, 水生动物具有非常复杂的氨氮运输调控网络, 而NKA是参与氨排泄的重要通道之一。
NKA是一种重要的阳离子泵蛋白, 由α亚基、β亚基及调节亚基组成, 其中α亚基包含阳离子、核苷酸以及配体结合位点(Cao et al, 2021)。NKA可以在ATP和Mg2+的催化下转运Na+和K+, 从而控制细胞质膜上的Na+、K+浓度梯度, 维持细胞内外液的渗透压(Čechová et al, 2016)。此外, 由于NH4+在水溶液中具有与K+几乎相同的物理特性, 因此NH4+可以取代K+通过NKA进行跨膜运输(Tresguerres et al, 2020)。目前, 在印度囊鳃鲇(Heteropneustes fossilis) (Chew et al, 2020)、龟壳攀鲈(Anabas testudineus) (Ip et al, 2012)、首长黄道蟹(Metacarcinus magister) (Martin et al, 2011)、岸蟹(Carcinus maenas) (Fehsenfeld et al, 2016)、克氏原螯虾(Procambarus clarkii) (Shen et al, 2021)、鳞砗磲(Tridacna squamosa) (Ip et al, 2015)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans) (Adlimoghaddam et al, 2015)等多种动物中已证明NKA参与氨氮的排泄过程。
近年来, 随着贝类基因组信息的丰富、高通量单核苷酸多态性(SNP)芯片的开发以及基因分型技术的快速发展, 全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)已广泛应用于贝类生长、抗逆和品质等重要经济性状的遗传位点鉴定。例如, 利用GWAS技术, 在虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)中筛选出了2个与生长显著关联的SNP位点(Ning et al, 2019), 在皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)中发掘了27个与耐高温性状相关的遗传标记(Meng et al, 2020), 在长牡蛎(Crassostrea gigas)中定位了一批与脂肪酸、糖原、锌等营养性状相关的SNP(Shi et al, 2020)。在耐氨氮关联SNP研究方面, Xu等(2019)已用GWAS分析在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)中鉴定出25个与耐氨氮性状相关的SNP及7个候选基因; Lv等(2023)利用GWAS分析在缢蛏(Sinonovacula constricta)中鉴定出11个与耐氨氮性状显著相关的SNP位点, 并进一步发掘了5个关联候选基因, 包括NKA、β-半乳糖苷酶(GLB1)、四肽重复蛋白28 (TTC28)、微管蛋白β (TUBB)和真核翻译延伸因子1a (eEF1A)。GWAS关联的SNP位点和候选基因作为重要的遗传标记, 对进一步研究氨氮耐受的分子调控机制和基因组选择育种具有重要意义。
缢蛏是我国重要的海水养殖贝类, 是虾(蟹)-贝混养模式的主要养殖种类, 该养殖系统中的大量残饵、粪便等有机废物会增加底泥中的氨氮含量, 而缢蛏是一种典型的底栖穴居双壳贝类, 其面临的氨氮环境尤为严峻(Cong et al, 2021; 柴欣如等, 2022)。已有大量研究表明, 缢蛏机体对于过量的氨存在特定的解毒方式和代谢途径(陈凯锋等, 2020; 张欢等, 2020; Sun et al, 2021; Lv et al, 2022)。本研究对课题组前期通过全基因组关联分析获得的与氨氮耐受性状显著关联的SNP位点(g.21062868T > A)进行了验证, 并开展了位点关联基因NKA的时间表达谱和蛋白组织定位分析, 探究氨氮胁迫下NKA基因在缢蛏鳃中的表达特征, 同时通过检测NKA基因干扰后NKCC1基因的mRNA表达量及血淋巴氨浓度, 探讨NKA在缢蛏氨氮排泄中发挥的作用, 为深入研究NKA在贝类氨氮解毒过程中的功能及调控机制奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料从宁波市海洋与渔业科技创新基地采集健康的1龄缢蛏[湿重(15.38±1.84) g, 壳长(59.36±2.52) mm], 实验前暂养7 d, 海水盐度为20±1, pH值为8.1±0.1, 温度为(19.4±0.4) ℃。每12 h更换1/2海水, 每天08:00和18:00投喂小球藻(Chlorella vulgaris)。
1.2 氨氮胁迫实验在进行氨氮胁迫实验前, 先随机取6颗缢蛏的鳃、肝胰腺、肠、足、外套膜、水管和闭壳肌, 液氮速冻后保存于–80 ℃超低温冰箱中, 用于组织表达分析。参考Zhang等(2020)缢蛏氨氮急性胁迫96 h的半致死浓度(LC50-96 h), 以氨氮浓度180 mg/L作为实验组, 并设置对照组(正常海水)。每组120颗缢蛏, 设置三个平行, 即每个平行40颗。分别在实验开始后0、3、6、12、24、48、72和96 h随机采集6颗缢蛏, 取其鳃, 液氮速冻完全后, 保存于–80 ℃超低温冰箱中, 用于实时荧光定量PCR (qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(western blotting, WB)检测。在胁迫96 h时, 分别从两组中取6颗缢蛏, 剪取鳃组织进行常规石蜡切片和NKA蛋白组织定位研究。
1.3 耐氨氮性状关联SNP位点的验证选取180 mg/L作为缢蛏氨氮胁迫实验的浓度, 每2 h对死亡个体进行采样, 实验共持续180 h, 取150颗最早死亡的个体(氨氮敏感组, SG, 18~96 h)和死亡率到达约80%时剩余的150颗存活个体(氨氮耐受组, TG, 180 h)的足经液氮速冻后储存在-80 ℃超低温冰箱中。使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN, 北京)提取总DNA, 通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性, 并使用Nano Drop2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, 美国)检测DNA浓度。
利用竞争性等位基因特异性PCR (KASP)分析技术进行基因分型。使用PolyMarker设计SNP位点(g.21062868T > A)的KASP引物(http://www.polymarker.info/)并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表 1)。使用384孔板进行KASP测定, 反应体系为10 μL, 包括5 μL FLu-Arms 2×PCR混合物、0.5 μL KASP引物混合物、1 μL基因组DNA (浓度为20 ng/μL)和3.5 μL去离子水。PCR程序在LightCycler® 480II PCR仪(Roche, 瑞士)中进行, 每次运行均包括非模板对照(NTC)。反应程序为: 94 ℃, 15 min; 94 ℃, 20 s, 61 ℃, 1 min, 共10个循环; 94 ℃, 20 s, 55 ℃, 1 min, 共26个循环。PCR扩增后使用Intellics软件(LGC Douglas Scientific, 美国)读取每个样本的基因型。
| 引物名称 | 序列(5'~3') | 用途 |
| Sc-NKA-F | CACACCACCGAAAACTAC | 实时荧光定量PCR |
| Sc-NKA-R | AGGCAACAAAACAGAGAA | |
| Sc-NKCC1-F | ATGTCTGGTGGCTCTTTG | |
| Sc-NKCC1-R | GAACTCCTGCTTGCTCTG | |
| 18S-F | TCGGTTCTATTGCGTTGGTTTT | |
| 18S-R | CAGTTGGCATCGTTTATGGTCA | |
| Sc-NKA-F1 | CCATGGGGATCCTGTAGCGATAAAACC | 构建重组质粒 |
| Sc-NKA-R1 | AAGCTTCTCGAGTGCACGATACTGATC | |
| siRNA-NKA-F | GCUUUGGAUUGGUGCCAUUTT | RNA干扰 |
| siRNA-NKA-R | AAUGGCACCAAUCCAAAGCTT | |
| NC-F | UUCUCCGAACGUGUCACGUTT | |
| NC-R | ACGUGACACGUUCGGAGAATT | |
| Sc-NKA-SNP-F1 | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAATACATGTATCAACTTGACGCTA | SNP验证 |
| Sc-NKA-SNP-F2 | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAATACATGTATCAACTTGACGCTT | |
| Sc-NKA-SNP-R | AGTAAAGTCTTTAAAATTACATAATCAGT |
使用Trizol法提取总RNA, 1%琼脂糖电泳检测其完整性, 使用Nano Drop2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, 美国)检测RNA浓度。使用PrimeScript® RT reagent kit with gDNA eraser (TaKaRa, 日本)合成cDNA。根据本实验室缢蛏基因组数据库中的NKA (GenBank登录号: MN052993.1)、NKCC1 (GenBank登录号: OQ244851)以及18S ribosomal RNA (18S) (GenBank登录号: AY695800.2)基因序列(Dong et al, 2020), 通过Primer Premier 5.0软件设计PCR引物(表 1), 并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。每对引物在进行荧光定量前都通过普通PCR验证。使用LightCycler® 480II PCR仪(Roche, 瑞士)进行qRT-PCR反应, 总体系为20 μL, 包括cDNA和ddH2O共8 μL, 10 µmol/L上下游引物各1 μL, 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, 南京) 10 μL。反应程序为: 95 ℃预变性10 min, 95 ℃ 10 s, 60 ℃退火1 min, 循环40次, 72 ℃延伸7 min, 运行结束后对PCR产物进行溶解曲线分析, 确保只有单一的PCR产物得到扩增。选择18S基因作为内参基因(表 1), 用2–ΔΔCt法计算缢蛏NKA基因(Sc-NKA)的相对表达量(Sun et al, 2022)。
1.5 Sc-NKA多克隆抗体制备及氨氮胁迫后Sc-NKA蛋白免疫印迹检测根据Sc-NKA基因序列设计引物(表 1), 扩增开放阅读框(ORF)区域。将获得的PCR产物连接到pET-32A(+)质粒(TaKaRa, 日本), 构建含有His-tag的融合蛋白表达重组质粒pET-32A-Sc-NKA。将阴性pET-32A质粒和阳性重组质粒分别转化到大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3)进行原核蛋白表达, 挑选阳性菌体接种至含抗生素的LB液体培养基中, 37 ℃振荡培养过夜。使用1 mmol/L IPTG在37 ℃下诱导4 h, 收集诱导表达后的菌体重悬并超声, 利用Ni-NTA树脂对蛋白进行纯化。随后将抗原与等体积的佐剂完全乳化后对新西兰白兔进行多点皮下注射。采集全血后进行抗体纯化和ELISA测定效价, 并将制备好的抗体保存于–20 ℃冰箱中。
利用RIPA裂解液(碧云天, 上海)裂解缢蛏鳃组织, 通过总蛋白定量测定试剂盒(南京建成)测定各样品的蛋白浓度, 并用裂解液稀释到同样浓度, 加入5×loading buffer沸水煮沸10 min。配置合适浓度的凝胶(12%分离胶和5%浓缩胶), 等量上样后进行SDS-PAGE电泳, 将凝胶中含有的目标蛋白转移到PVDF膜上(60 mA, 3 h), 利用TBST溶解的10%脱脂奶粉室温下封闭1 h。然后分别利用兔抗Sc-NKA多克隆抗体(HuaBio, 杭州, 1︰500比例稀释)和兔抗GAPDH多克隆抗体(上海生工, 1︰3 000比例稀释)在4 ℃下孵育过夜, 再用HRP标记的驴抗兔IgG在室温下进行二抗孵育(上海生工, 1︰2 000比例稀释) 1 h。最后, 将增强化学发光液(ECL)滴加至PVDF膜上, 在凝胶成像系统(Bio-Rad, 美国)下观察和拍摄图像。以GAPDH作为内参蛋白, 利用ImageJ2软件对结果进行灰度值计算(Sun et al, 2022)。
1.6 Sc-NKA蛋白免疫荧光检测鳃样品用4%多聚甲醛固定, 然后在梯度乙醇(50%、70%、80%、90%、100%)中脱水, 置于二甲苯中透明, 石蜡包埋切片(厚度为4 µm)。将烤片后的组织切片用二甲苯脱蜡, 梯度乙醇复水, 置于0.01 mol/L柠檬酸钠溶液中进行抗原修复; 用5%牛血清白蛋白(BSA, 生工生物工程, 上海)室温封闭1 h, 甩干后滴加兔抗Sc-NKA多克隆抗体(HuaBio, 杭州, 1︰400比例稀释)于4 ℃湿盒中孵育过夜; 滴加FITC标记的驴抗兔IgG二抗(1︰150比例稀释)室温避光孵育1 h; 滴加DAPI染色液(碧云天, 上海)对细胞核进行染色, 在Eclipse 80i荧光显微镜(Nikon, 日本)下观察并拍摄鳃组织。
1.7 RNA干扰实验Sc-NKA和阴性对照(NC, 非特异性的siRNA对照)的siRNA序列由生工生物工程(上海)股份有限公司制备(表 1, 利用无RNase水将干扰链配制成0.22 μg/μL。将240颗缢蛏随机分为氨氮胁迫组(AG, 180 mg/L)和对照组(CG, 正常海水), 使用50 μL微量进样器将siRNA-NKA干扰链、NC链及无RNase水(空白对照) 18.45 μL分别注射到两组40颗缢蛏的闭壳肌中。在注射后0、6、12、24和48 h随机收集各缸中6颗缢蛏, 采集其鳃和血淋巴用于qRT-PCR检测和血氨浓度测定。
1.8 血氨浓度测定依据血氨测定试剂盒(A086-1-1, 南京建成)说明书检测样品反应后的吸光值。其原理主要是用蛋白质沉淀剂将血清中的蛋白沉淀以抑制酶活性, 防止游离氨产生, 并去除大部分干扰呈色的物质。通过Berthelot反应在630 nm处测定吸光值, 与标准溶液比较计算血淋巴中的氨浓度。根据公式计算样品中的血氨浓度:
(1)使用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(ANOVA), P < 0.05表示差异显著, P < 0.01表示差异极显著，所有实验数据均以平均值±标准差(SD)表示。用卡方(χ2)检验计算SNP位点在SG组和TG组间基因型频率的差异。使用GraphPad Prism 8.0软件进行绘图。
2 结果 2.1 耐氨氮性状关联SNP位点的验证与分析应用KASP分析方法在验证群体中对SNP位点(g.21062868T > A)进行基因分型, 并与缢蛏耐氨氮性状进行关联分析, 分别在TG组和SG组中检测到148和150个荧光信号。分析结果表明, 该SNP位点存在3种基因型, 其中纯合子TT为优势基因型, 在TG组有92个个体, SG组有74个个体, 在两组中的基因型频率分别为62.16%和49.33%; 杂合子TA在TG组有18个个体, SG组有37个个体, 在两组中的基因型频率分别为12.16%和24.67%; 纯合子AA在TG组有38个个体, SG组有39个个体, 在两组中的基因型频率分别为25.68%和26.00%。对TG组和SG组的基因型频率进行卡方检验后发现, 该SNP位点在两组间差异显著(P < 0.05) (表 2)。
| 位点 | 基因型 | 数量/基因型频率/(%) | χ2/P-value | 等位基因 | 等位基因频率/% | 突变类型 | ||
| TG | SG | TG | SG | |||||
| g.21062868T > A | TT | 92/62.16 | 74/49.33 | 8.515/0.014* | T | 68.24 | 61.66 | 颠换 |
| TA | 18/12.16 | 37/24.67 | A | 31.76 | 38.34 | |||
| AA | 38/25.68 | 39/26.00 | ||||||
| 注: n=150; *表示氨氮耐受组(TG)与氨氮敏感组(SG)组之间基因型频率差异显著(P < 0.05) | ||||||||
利用qRT-PCR和WB技术检测了Sc-NKA基因在缢蛏不同组织中的表达量以及在氨氮胁迫下鳃中mRNA和蛋白的表达水平。结果显示, Sc-NKA基因在鳃、肝胰腺、肠、足、外套膜、水管和闭壳肌中均有表达, 且在鳃组织中的表达量最高(P < 0.05), 其次是肠和肝胰腺, 在外套膜、闭壳肌和足中的表达量最低(图 1a)。在180 mg/L的高氨胁迫后, 鳃中Sc-NKA基因mRNA表达水平在6~48 h相比0 h显著升高(P < 0.05), 总体呈现先升高后降低的趋势, 且在24 h达到最大值, 约为0 h的2倍(图 1b)。通过对Sc-NKA蛋白印迹灰度值分析发现, WB的结果与qRT-PCR基本一致(图 1c)。
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| 图 1 缢蛏Sc-NKA基因的组织表达分析及在氨氮胁迫下鳃中mRNA和蛋白的表达变化 Fig. 1 Expression of Sc-NKA in different tissues and the mRNA and protein expression in the gill of S. constricta under ammonia stress 注: a. Sc-NKA基因mRNA在缢蛏不同组织中的表达分析; b. 180 mg/L氨氮胁迫96 h后鳃组织中Sc-NKA mRNA的表达分析; c. 180 mg/L氨氮胁迫下鳃组织中Sc-NKA和GAPDH的表达分析。Sc-NKA蛋白的相对表达由目标蛋白/GAPDH的灰度值得到。数值表示为平均值±标准差(n=6); 使用单因素方差分析, 不同小写字母间存在显著差异(P < 0.05) |
缢蛏的鳃丝由单层上皮细胞(柱状细胞和扁平细胞)以及其围绕的血腔组成。DAPI染色显示, 鳃组织纤毛处含有大量排列整齐的单层柱状细胞, 而靠近鳃内腔的约一半区域为扁平细胞。免疫荧光结果显示, Sc-NKA在鳃组织的柱状细胞和扁平细胞中均有表达(FITC绿色荧光信号), 且其在柱状细胞中的荧光信号强于其他部位。同时, 与CG组相比, TG组表现出更强烈的阳性信号(图 2)。
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| 图 2 缢蛏鳃组织Sc-NKA蛋白的免疫荧光分析 Fig. 2 Immunofluorescence of Sc-NKA in the gill 注: 抗-NKA抗体使Sc-NKA蛋白染为绿色, DAPI使细胞核染为蓝色。其中CG为对照组(正常海水养殖), AG为氨氮胁迫组(180 mg/L)。CC: 柱状细胞; FC: 扁平细胞; BS: 血腔; F: 前纤毛; L: 侧纤毛。比例尺为50 μm |
利用RNAi技术检测了Sc-NKA基因表达受到抑制后对NKCC1基因表达和血氨含量的影响。qRT-PCR结果表明, 注射siRNA-NKA干扰链6、12、24和48 h后, AG组和CG组Sc-NKA的mRNA表达水平显著下调(P < 0.05), 其中AG组干扰效率分别为23%、84%、83%和80%, CG组分别为33%、78%、85%和79% (图 3a, 3b)。对Sc-NKA基因的干扰影响了Sc-NKCC1的mRNA表达水平。在12~48 h, AG和CG两组中siRNA-NKA实验组的Sc-NKCC1表达量相较阴性和空白对照组均显著降低(P < 0.05), 其中AG组在12、24和48 h分别下降37%、99%和99%, CG组分别下降44%、80%和95%。同时, 整个干扰实验期间siRNA-NKA实验组的Sc-NKCC1 mRNA表达水平总体呈现下降趋势, 与Sc-NKA的表达量变化趋势一致(图 3c, 3d)。
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| 图 3 RNAi后鳃组织中Sc-NKA和Sc-NKCC1基因mRNA相对表达量和血氨浓度的变化 Fig. 3 Relative expression of Sc-NKA and Sc-NKCC1 gene in the gill and ammonia concentration in the hemolymph after RNAi 注: a. 氨氮胁迫组(AG, 180 mg/L) RNAi后Sc-NKA基因的mRNA表达分析; b. 对照组(CG, 正常海水养殖) RNAi后Sc-NKA基因的mRNA表达分析; c. AG组RNAi后Sc-NKCC1基因的mRNA相对表达水平; d. CG组RNAi后Sc-NKCC1基因的mRNA相对表达水平; e. AG组RNAi后缢蛏血氨浓度; f. CG组RNAi后缢蛏血氨浓度。数值表示为平均值±标准差(n=6)。*表示siRNA-NKA实验组与阴性对照(NC)和空白对照(无RNase水)组之间差异显著(P < 0.05); **表示siRNA-NKA与阴性和空白对照组之间差异极显著(P < 0.01) |
使用血氨测定试剂盒测定Sc-NKA基因RNAi后缢蛏血淋巴中的氨浓度。结果表明, AG组和CG组的siRNA-NKA实验组中血氨浓度在6~48 h均显著高于阴性和空白对照组(P < 0.05), 其中AG组血氨浓度在48 h达到最大值(5 163.16 μmol/L), 约为对照组的2.32倍; CG组血氨浓度在6 h达到最大值(161.03 μmol/L), 约为对照组的1.23倍(图 3e, 3f)。此外, 在实验期间, 阴性和空白对照组的上述指标之间均没有显著差异(P > 0.05) (图 3a~3f)。
3 讨论氨氮是水产养殖环境中最常见的胁迫因子之一, 氨氮水平的升高是水生动物健康和生命的主要威胁(Zhao et al, 1997; Harris et al, 2001)。氨氮浓度过高会对机体产生多种危害, 因此需要将其转化成毒性较小的分子或迅速排出, 以避免有害物质在体内积聚(Larsen et al, 2014)。缢蛏作为一种底栖滤食性贝类, 经常面临高浓度的氨氮环境, 是研究氨氮解毒分子机制的重要模式物种(Peng et al, 2016)。本课题组Lv等(2023)对缢蛏耐氨氮性状进行了GWAS分析, 发现了一个位于NKA基因(Chr8: 21038162-21054270)下游8.6 kb基因间区内的显著性SNP位点(g.21062868T > A) (P < 0.05), 本实验通过KASP技术验证了其与缢蛏氨氮耐受性状之间存在显著关联(P < 0.05), 推测该SNP可能通过影响与其相邻的NKA基因的表达参与氨氮胁迫下的调控过程。近年来, 许多研究表明, 基因间区包含非编码RNA如miRNA、rRNA、snRNA和tRNA等尚未鉴定的重要功能元件(Hess et al, 2007; Zhong et al, 2014; Cai et al, 2016; Kanwal et al, 2019)。基因间区含有的增强子DNA序列可以控制相距几千个碱基对以上的离散基因的表达(Ingvarsson et al, 2016; Bakhtiarizadeh et al, 2018)。这一发现也在水产动物中得到广泛验证, 如在对刺参(Apostichopus japonicus)疣足数量进行GWAS分析中, 筛选并验证了与PATS1基因相邻的位于基因间区的显著性SNP位点, 证明其在细胞生长和增殖中的重要作用(Zhu et al, 2022); 在对长牡蛎脂肪酸品质性状的GWAS分析中, 选取了7个与不饱和脂肪酸含量显著相关的SNP位点, 这些位点均位于基因间区, 最后通过分析与这些SNP相邻的NFYA基因的mRNA表达水平等方式证明该基因可能参与调控牡蛎饱和脂肪酸代谢(史瑞辉, 2020)。
研究表明, 绝大多数水生生物, 包括两栖动物、硬骨鱼和大多数无脊椎动物的大部分含氮废物都是直接以NH4+的形式排出, 这是因为NH3在水环境中很容易转化为NH4+并通过离子转运系统由鳃排泄到体外(Cragg et al, 1961; Wood et al, 1989; Wright, 1995; Weihrauch et al, 2009; Wright et al, 2009)。水生动物的鳃是一个多功能器官, 是进行多种生理过程的场所, 包括氨排泄、离子转运、酸碱平衡和气体交换等(涂翰卿等, 2019)。作为离子调节系统中的重要成员, NKA通常在鳃中发挥作用(Henry et al, 2012)。在对遮目鱼(Chanos chanos)鳃中的NKA蛋白进行免疫荧光检测后发现, NKA位于鳃上皮细胞的基底外侧膜上(Tang et al, 2011)。同样, 在黑小鲵(Hynobius nigrescens)的鳃扁平细胞和富含线粒体的细胞基底外侧膜上观察到了NKA的免疫阳性反应(Uchiyama et al, 2011)。本研究发现, NKA定位于缢蛏鳃的扁平细胞与柱状细胞中, 与参与渗透调节的水通道蛋白(AQP)在鳃中的定位结果较为一致(Ruan et al, 2022)。此外, 氨氮胁迫后的NKA阳性信号较未胁迫的对照组明显更强, 且高氨胁迫下鳃中NKA基因的mRNA和蛋白表达水平均有显著上调(P < 0.05), 这一现象在印度囊鳃鲇(Chew et al, 2020)和龟壳攀鲈(Ip et al, 2012)中也有发现, 表明NKA对氨氮刺激具有明显的响应。在亚致死氨氮浓度(1.5 mg/L和3 mg/L)胁迫下菲律宾蛤仔(Tapes philippinarum)鳃中的NKA酶活性明显增强(P < 0.05), 且用相同浓度的K+或NH4+进行体外实验时, NKA均受到最大程度的激活, 表明NH4+可以替代K+从而被NKA运输(Pagliarani et al, 2008)。暴露于高氨下, NKA基因的高表达可能是调节机体对氨氮应激的适应性反应: NKA可以像结合K+一样结合NH4+, 然后直接将其从细胞中转运出来(Tresguerres et al, 2020)。在本研究中, 高氨胁迫6~48 h, NKA基因的持续高表达表明, 短期氨氮胁迫下缢蛏可通过诱导NKA基因mRNA的转录水平和蛋白丰度上调, 来促进鳃中NH4+的跨膜转运。
NH4+在水溶液中不能通过自由扩散的方式穿过细胞膜, 而需要转运蛋白参与(Henry et al, 2012)。由于NH4+与K+的离子半径、迁移率等物理特性相似, NH4+可以竞争性结合K+转运蛋白, 如NKA、NKCC和KCN (Kinne et al, 1986; Choe et al, 2000; Weiner et al, 2007)。研究发现, 红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、热带雀鳝(Atractosteus tropiccus)、许氏齿弹涂鱼(Periophthalmodon schlosseri)在氨氮胁迫下鳃中NKA和NKCC1的mRNA表达水平均上调, 表明二者在氨排泄过程中均发挥作用(Nawata et al, 2010; Chew et al, 2015; Aranda-Morales et al, 2021)。本实验通过对Sc-NKA基因进行RNAi后发现, 缢蛏血淋巴氨浓度在干扰后显著升高, 证实了NKA在氨氮转运中的重要作用。同时, qRT-PCR检测Sc-NKA基因干扰后Sc-NKCC1的mRNA表达量发现, 对NKA基因的抑制会下调NKCC1基因的转录水平, 表明两者之间可能存在着协同作用。水生生物通过鳃细胞基底外侧膜上的NKCC1替代K+运输NH4+的生理活动将导致流入上皮细胞的Na+增加, 因此, 增强NKA酶的活性对于维持Na+电化学梯度至关重要(Chew et al, 2020)。也有研究推测, NKA能够维持Na+梯度进而驱动NKCC1 (任琴, 2015)。结合本研究的实验结果, 当NKA表达水平降低时, 细胞内的Na+浓度将增加, 影响细胞内外的Na+浓度梯度, 进而使NKCC1的表达受到抑制。
4 结论本研究在缢蛏氨氮耐受和敏感群体中验证了位于NKA基因下游的SNP位点(g.21062868T > A)与氨氮耐受性状存在显著关联性(P < 0.05), 分析了该基因在高氨胁迫下的时空表达规律, 发现氨氮刺激可以诱导Sc-NKA的高表达。Sc-NKA蛋白定位于缢蛏鳃的柱状细胞和扁平细胞中, 并且在氨氮胁迫后蛋白丰度增加。此外, 干扰Sc-NKA使血淋巴中的氨浓度升高, 并下调了同为K+转运蛋白的Sc-NKCC1基因的转录水平, 这表明Sc-NKA在氨运输过程中具有重要作用。后续将深入探究NKA与其他转运蛋白在氨氮排泄中的互作关系, 为进一步阐明缢蛏氨氮胁迫响应分子机制奠定理论基础, 也为耐氨氮新品种的分子标记辅助选育工作提供候选基因。
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