针盘海牛属Diaulula Bergh, 1878隶属于腹足纲Gastropoda、裸鳃目Nudibranchia、盘海牛科Discodorididae。该属种类分布广, 在太平洋、大西洋和南非海域均有分布, 多数种类生活在潮间带或浅海岩礁上, 以海绵为食(Marcus et al, 1967; Valdés et al, 2010), 目前仅有2种在深海有分布(Valdés, 2001)。自针盘海牛属建立以来, 有学者认为该属种类在生活方式和形状、身体大小、齿舌以及生殖系统结构特征等方面均与盘海牛属Discodoris Bergh, 1877种类极为相似, 因此将针盘海牛属看作后者的同物异名(Thompson, 1975; McDonald, 1983)。然而, 这一观点并未被一些学者所接受(如Behrens, 1991)。Valdés(2001)基于形态学比较, 认为针盘海牛属种类的背部具带有骨针的瘤状突起, 前列腺分为两部分, 这些特征可明显区分于盘海牛属。

欧氏针盘海牛Diaulula odonoghuei (Steinberg, 1963)在北太平洋海域从韩国(Koh, 2006)、日本(Baba, 1957)、俄罗斯(Martynov et al, 2015), 到北美洲西海岸的加拿大和美国(Kelly, 2013; Lindsay et al, 2016)均有分布, 栖息于潮间带或浅水区的岩礁上。迄今, 我国已记录了盘海牛科中其他4属9种(张素萍, 2008; 张素萍等, 2016), 但尚未对针盘海牛属种类进行过研究和报道。近年来, 作者对黄渤海的裸鳃类进行调查时, 采集到欧氏针盘海牛2个标本, 系我国新记录属及新记录种。本文中, 作者基于形态学和分子生物学对其进行了研究报道。

1 材料与方法 1.1 实验材料

本实验所用的盘海牛标本于2021年3月10日采自大连市黑石礁潮间带, 共2个标本, 活体体长约为40 mm。标本(酒精浸制)保存于中国科学院海洋生物标本馆, 标本号为: MBM287595和MBM287596。

1.2 实验方法 1.2.1 形态学研究

活体采集后, 带回实验室进行暂养。在体式显微镜下对外部形态的细微特征进行了观察, 利用数码相机对其进行了拍照, 并用卡尺对其体长进行了测量。

齿舌的解剖: 沿动物的背部中线将外套膜剪开, 用探针挑出口球部, 用解剖针及镊子初步清除口球肌肉及齿舌上附着的组织后, 放入10% NaOH溶液, 室温浸泡3~4 h或60 ℃浸泡1~2 h, 期间振荡数次以彻底去除附带组织。

扫描电镜拍摄: 将前期准备的齿舌放在载玻片上, 展平后进行空气干燥, 将干燥后的齿舌用导电胶粘在样品台上, 放入镀膜机内喷金, 后放入扫描电镜内, 5 kV加速电压下进行观察拍照。

1.2.2 分子生物学研究

切取2个标本的足部肌肉各约30 mg, 使用TIANGEN海洋生物基因组DNA抽提试剂盒(北京, 天根生化科技)提取基因组DNA, 并在将所提取DNA溶解后置于4℃冰箱保存备用。

用于扩增样品线粒体COI基因的引物序列为LCO1490 (5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG– 3′)和HCO2198 (5′-TTAACTTCAGGGTGACC AAAAAATCA-3′) (Folmer et al, 1994); 用于扩增线粒体16S rRNA的引物序列为16S arL (5′-CGCCTGT TTAACAAAAACAT-3′, Palumbi et al, 2002)和16S R (5′-CCGRTYTGAACTC AGCTCACG-3′, Puslednik et al, 2008); 用于扩增核基因H3的引物序列为HexAF (F) (5′-ATGGCTCGTACCAAGCAGACGGC-3′)和(5′-ATATCCTTGGGCATGATGGTGAC-3′) (Colgan et al, 1998)。引物稀释浓度为10 μmol/L, –20 ℃保存备用。

PCR反应总体积为25 μL, 其中包括2 μL模板DNA, 12.5 μL Taq Mix, 引物各0.5 μL, 双蒸水加至总体积。PCR反应程序为: 95 ℃预变性3 min, 95 ℃变性30s, 45 ℃退火45 s, 72 ℃延伸10 min。在进行1%琼脂糖凝胶电泳检测(U=5 V/cm)进行确认之后, 将所得PCR产物送至青岛擎科生物技术有限公司进行测序。

将测得的基因片段与从GenBank中下载的针盘海牛属Diaulula的同源序列进行分析(见表 1), 利用MEGA X将COI和H3基因片段翻译成氨基酸序列进行比对和人工校对, 利用MAFFT软件对16S rRNA进行聚类, 并用Gblocks软件去除非信息位点。随后, 将这三个基因串联成用于建立系统发育树的多基因序列, 长度为1 423 bp, 其中包括COI 657 bp、16S rRNA 439 bp以及H3 327 bp。根据ModelFinder计算最佳分区模型, 得到的COI和16S rRNA的最佳模型均为HKY+F+I, H3的最佳模型为HKY+F, 基于贝叶斯(BI)以及最大似然法(ML)分别构建系统发育树。使用MEGA X计算针盘海牛属种类种内和种间的遗传距离。

2 结果 2.1 形态学描述

欧氏针盘海牛  Diaulula odonoghuei (Steinberg, 1963) (图 1, 图 2)

Doris odonoghuei Steinberg, 1963: 63.

Doris echinata O'Donoghue, 1922: 149.

Doridigitata maculata O'Donoghue, 1926: 206.

Diaulula odonoghuei: Lindsay et al, 2016: 4, figs. A-B, E-G.

Diaulula boreopacifica Martynov: Sanamyan & Korshunova, 2015: 68, fig. 2b.

模式标本产地  加拿大温哥华岛(Vancouver Island)。

标本采集地  辽宁(大连黑石礁)。

观察标本  2个标本, 黄海, 潮间带岩礁, 2021.Ⅲ.10, 张树乾采。

形态描述  动物中等大小, 体长40 mm, 呈椭圆形, 低平。外套背面密布有瘤状突起, 每个突起的周缘具5个直立的骨针。口触手呈指状。嗅角粗壮, 上部约有18个褶叶, 末端呈乳头状; 嗅角鞘低, 边缘具瘤状突起, 嗅角可完全缩入嗅角鞘内。鳃羽状, 6叶, 3歧分枝, 围绕肛门突起排列成圆形, 可完全缩入鳃腔内。足部宽大, 呈椭圆形, 后端可在动物伸展时突出外套后方。体色为淡黄色, 外套背部两侧具有排列不规则、大小不等的、呈圆形的黑色斑点。

齿舌齿式为20·0·20。中央齿缺, 侧齿呈钩状, 前10对侧齿逐渐变大, 随后侧齿逐渐向外缘变小。

生态习性  生活于潮间带至浅水区的岩礁间, 以海绵为食。

地理分布  欧氏针盘海牛在北太平洋分布广泛, 见于韩国、日本、俄罗斯, 加拿大和美国西海岸。本种在我国沿海为首次报道。

2.2 COI基因分析和系统进化分析

测序获得本研究2个欧氏针盘海牛标本的COI基因序列, 结合GenBank下载的针盘海牛属种类的COI基因序列进行对比分析, 两端对齐, 获得一致序列639bp。基于Kimura-2-parameter模型计算各针盘海牛种内及种间遗传距离。4种针盘海牛属种类的种内遗传距离为0%~1.9%, 种间遗传距离为7.5%~23.7%。比较欧氏针盘海牛与其余3种针盘海牛遗传距离可知, 欧氏针盘海牛与Diaulula sandiegensis的遗传距离最近(7.5%~8.7%), 与Diaulula greeleyi的遗传距离最远(23.1%~23.7%)。在分析的5个欧氏针盘海牛个体中, 中国海的个体与日本海的个体具有最近的遗传距离(0.2%), 而与俄罗斯和美国的个体的遗传距离分别为1.8%。

以同科中的两个围鳃海牛属Jorunna种类作为外群, 基于最大似然法以及贝叶斯法构建系统发育树。

两种算法获得的系统发育树具有基本相同的拓扑结构(图 3)。针盘海牛属的4个种类聚为一个单系分支, 不同的种聚在不同的分支上, 节点均拥有较高的支持率。在欧氏针盘海牛的分支上, 本研究所用的个体与日本的个体先聚在一起, 随后该分支再与俄罗斯和美国的个体相聚。

3 讨论

本研究所用标本的形态特征与欧氏针盘海牛Diaulula odonoghuei (Steinberg, 1963)的原始描述特征及其他文献的描述相吻合。由于欧氏针盘海牛在外部形态、齿舌特征以及生殖系统构造方面与Diaulula sandiegensis (J. G. Cooper, 1863)均十分相似, 因此常被认为是后者的同物异名(Behrens et al, 2001)。然而, 近年来的分子生物学研究证实了它们为不同的种(Lindsay et al, 2016)。基于分子结果, Lindsay等(2016)对这两个种的外部形态进行了进一步的比较, 发现它们之间存在稳定的形态差异, 即: 欧氏针盘海牛背部的黑色斑点全部为实心状, 而Diaulula sandiegensis背部的黑色斑点为环形。Diaulula odonoghuei分布于日本海至加利福尼亚北部, Diaulula sandiegensis仅分布于加利福尼亚, 两者的分布范围在加利福尼亚北部有一定的重合。

Martynov等(2015)认为Diaulula odonoghuei的原始描述过于简单, 并不能证明该种属于针盘海牛属Diaulula, 而很可能属于盘海牛科中的其他属, 因此, 对其种名的有效性提出异议。事实上, 在Diaulula odonoghuei的原始描述中, O’Donoghue (1922)明确指出其背部具带有骨针的瘤状突起, 另外还对齿舌和一些解剖结构进行了描述, 这些特征均与针盘海牛属Diaulula的特征相吻合。此外, Lindsay等(2016)在模式种产地附近又重新采到了Diaulula odonoghuei标本, 通过形态学和分子生物学研究进一步确认了该种为针盘海牛属种类, 从而证实了它的有效性。

4 结论

本文基于形态学和分子生物学研究, 报道了中国海盘海牛科1记录属和1新记录种: 欧氏针盘海牛Diaulula odonoghuei (Steinberg, 1963)。该种在北太平洋海域的分布范围极广, 从韩国、日本、俄罗斯, 到北美洲西海岸的加拿大和美国均有分布。欧氏针盘海牛在中国海的发现, 不仅丰富了中国海软体动物多样性研究内容, 也为更好地理解该种在北太平洋的扩散和演化提供了新的数据和资料。