长毛对虾(Penaeus penicillatus)又称红虾、大虾、明虾等, 隶属于节肢动物门(Arthropoda), 甲壳纲(Crustacea), 十足目(Decapoda), 对虾科(Penaeidae), 对虾属(Penaeus), 属暖水性大型虾类, 广泛分布于我国福建、海南、广东和台湾等沿海地区, 是我国水产养殖中重要的经济虾类(王渊源, 1981; 王春忠等, 2014)。长毛对虾具有生长速度快、存活率高、抗逆性强等特点。长毛对虾的温度的适应性较广, 生存温度为10~40 ℃, 在低温条件下, 长毛对虾的生长速度比其它虾种的生长速度快。自20世纪50年代长毛对虾人工苗种技术取得突破之后, 长毛对虾一度成为我国南方沿海越冬时的首选换季虾种之一(张桂玲, 2009; 张桂玲等, 2010; 袁艺, 2016)。20世纪90年代, 仅福建省长毛对虾养殖规模就已超过1.33万hm²。然而近年来随着海洋环境恶化、病害频发以及过度捕捞等原因, 长毛对虾资源量急剧下降(陈炎辉等, 1996; 刘胜男等, 2019)。

增殖放流是指向自然水体中投放人工繁育的苗种以增加种群数量、优化群落结构, 是恢复渔业资源的重要手段之一(Li, 1999)。自1980年起, 我国各地区相继开展长毛对虾增殖放流工作(张桂玲, 2009)。福建省最早于1982年在东吾洋进行长毛对虾的增殖放流, 放流总量超过700万尾(关金藏, 1984)。2003~2009年, 福建省连续6年在罗源湾等海域放流长毛对虾共计11.4亿尾, 通过增殖放流不仅能使渔业资源得到恢复性增长, 而且还能产生明显的社会、生态、经济效益, 据统计, 罗源湾海域的长毛对虾捕捞量平均以每年9.4%的速度快速增长, 放流效果显著(董海, 2009; 杨爽等, 2014)。

随着增殖放流活动持续开展以及规模不断扩大, 如何对放流效果进行准确有效的评估也变得尤为重要(张崇良等, 2022)。目前, 标志回捕法是增殖放流效果评估的主要方法(李小芳, 2012), 传统的标记主要包括物理标记和化学标记。物理标记是利用标志挂牌、剪鳍等方式对个体进行区分, 其缺点是对幼体伤害较大、标志易脱落等(王陌桑, 2016)。化学标记是对幼体注射荧光标志物等, 但化学标记具有成本较高、检测复杂, 有可能对环境造成污染等缺陷(Phinney et al, 1967; Catalano et al, 2001)。因此, 传统的标记方法难以对放流效果进行有效的评估。

系谱信息是水生动物良种选育的关键, 主要体现在群体遗传力的计算、亲子关系的鉴定以及育种方案的制定等。然而我国多数水生动物并没有建立起一套完整、准确的系谱信息(殷彬等, 2017)。错误的系谱信息往往会增加近亲繁殖的可能, 导致种质资源衰退、遗传多样性降低, 影响良种选育的进程(朱克诚等, 2020)。因此, 开展系谱信息的相关研究具有十分重要的意义。目前, 应用较多的为微卫星标记和SNP标记等分子标记。微卫星标记具有基因座小、多态性高、共显性、分辨力高等优点而被广泛应用在水产动物的系谱分析和亲子鉴定研究(Chowdhury et al, 2021), 但基于微卫星标记的亲子鉴定方法在基因分型过程中会遇到基因分型错误、等位基因缺失等问题, 影响其鉴定结果(Hoffman et al, 2005; Tokarska et al, 2009)。近些年发展起来的单核苷酸多态性(SNP)是一种共显性的双等位基因分子标记, 具有遗传稳定性高、位点分布广泛、易实现高通量检测以及基因分型错误率低等优点(Yue et al, 2014; Nguyen et al, 2018; Van Deventer et al, 2020), 是一种更准确可靠的分子标记。相比于SSR标记, SNP标记的亲子鉴定效力更高, 更能够准确有效的评估增值放流效果。目前, SNP标记正迅速取代亲子鉴定研究中的微卫星标记, 成为各种水生生物系谱追踪的主流标记之一, 并逐步用于增殖放流效果的评估。

通过SNP标记对群体进行亲子鉴定以及遗传多样性等分析, 能够高效地选择繁育材料, 对物种的良种选育、遗传分化等研究具有重要的作用(申淑慧等, 2020)。近些年来, SNP标记在亲子鉴定、遗传多样性分析以及育种等方面的已有较多报道。如在陆生动物中, Sölzer等(2022)基于SNP标记对荷斯坦奶牛(Bos taurus)遗传力进行估计, 并成功找到了两个与牛爪病关联的基因。余国春(2014)利用120个SNP标记成功对猪(Sus scrofa f. domestica)的24个样本进行亲缘关系鉴定, 鉴定结果与真实系谱关系完全一致。在水生生物中, Zhao等(2018)使用58个SNP标记在大口黑鲈(Micropterus salmoides)群体中进行亲子鉴定, 刘峻宇等(2021)使用37个SNP标记对22个凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)进行了遗传多样性和亲子鉴定分析。然而, 目前长毛对虾尚缺乏SNP标记, 也没有看到基于SNP标记对长毛对虾进行亲子鉴定技术的相关报道。

为此, 本研究首先初步组装了长毛对虾的基因组, 接着利用长毛对虾的基因组重测序数据开发出大量SNP标记, 然后对这些标记进行筛选、评估, 最终建立了基于SNP标记长毛对虾的亲子鉴定技术。研究结果可为长毛对虾的增殖放流效果评估、遗传多样性分析提供参考。

1 材料与方法 1.1 实验样品与DNA提取

实验于2021年8月1日在福建省虹海水产开发有限公司进行。已抱卵的雌虾由渔民在海区采捕, 运回养殖厂后置于一个产卵池中自然产卵。当雌虾产卵后, 将卵用200目过滤网收集后转入到新的水泥池进行孵化、养殖。待子代虾苗养殖至体长1 cm以上时, 随机取49尾仔虾保存于80%乙醇中备用。同时, 剪取91尾亲虾的腹部肌肉组织保存于80%乙醇中, 备用。

使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根, 北京)提取91尾亲虾和49尾仔虾的DNA。使用1%的琼脂糖凝胶电泳和酶标仪对DNA质量和浓度进行检测。提取的基因组DNA储存在–20 ℃备用。

1.2 长毛对虾基因组初步组装

选取1尾海区捕捞的长毛对虾进行基因组De novo测序, 获得原始数据后, 使用Trimmomatic软件(Bolger et al, 2014)对原始数据进行过滤, 清除低质量、接头污染以及N碱基含量过高的序列后获得clean data。随后, 使用SOAPdenovo2软件(Xie et al, 2014)对clean data进行拼接、组装, 获得长毛对虾的参考基因组。

1.3 SNP标记开发与过滤

对140尾长毛对虾进行全基因组重测序, 通过BWA+GATK的Pipeline (McKenna et al, 2010)进行SNP挖掘。首先使用BWA、SAMtools (Li et al, 2009)以及GATK构建基因组索引, 利用BWA软件将每个样品序列Mapping到参考基因组上, 通过SAMtools软件去除重复的reads并排序得到bam文件, 最后运行GATK软件进行SNP Calling, 开发长毛对虾的SNP标记。为了减少低质量和假阳性位点对后续分析准确性造成干扰, 使用VCFtools软件(Danecek et al, 2011)对原始SNP位点过滤, 过滤条件为: (1) 最低的质量分数(minQ) ≥30; (2) 过滤次要等位基因深度 < 3的SNP; (3) 删除缺失率 > 5%的SNP; (4) 仅保留二等位基因; (5) 保留次要等位基因频率 > 0.05的SNP。

1.4 亲子鉴定技术的建立

使用CERVUS软件(Kalinowski et al, 2007)进行亲子鉴定分析。CERVUS是基于最大似然法的原理来推断亲子关系。在CERVUS软件中, LOD值(log- likelihood ratio)是进行亲子关系判定的重要指标。在进行鉴定时, 当LOD值为正数时表明假设亲本与子代之间可能存在亲子关系, 且LOD越大, 可靠性越强。实验使用的长毛对虾亲本是来自于海区捕获的抱卵雌虾, 所以孵化出的长毛对虾子代只能确定其母本, 无法确定其父本。因此, 本研究选择单亲母权亲子鉴定模型对长毛对虾进行亲子关系鉴定, 对于当前的研究分析, 只有置信度达到95%以上时, 子代才会被视为正确的分配给亲本。进行亲子鉴定时, 模拟参数如下: 91个候选母本产生10 000个模拟后代, 100%的母本被抽样, “最小分型基因座”设置为SNP总数的一半, 1%的分型错误率, 设置80%和95%两个置信度。

本研究从次要等位基因频率(minor allele frequency, MAF)、SNP数量两个方面对亲子鉴定结果进行优化、分析。首先, 在保持SNP个数不变的情况下, 对MAF值的重要性进行分析。根据MAF的大小, 设置若干组MAF, 每组随机挑选相同的SNP位点进行亲子鉴定分析; 接着, 根据上一步的结果, 在保持MAF值相对恒定的情况下, 对SNP个数进行优化, 形成若干组SNP组合, 进行亲子鉴定分析; 然后再综合其它参数对SNP个数进行进一步的优化, 最终确定适合长毛对虾亲子鉴定的SNP标记个数。

2 结果 2.1 长毛对虾基因组初步组装

利用Platanus软件(Pryszcz et al, 2016)计算组装长毛对虾基因组最佳K值, 结果显示当K=27时, 组装效果较好。基于K=27, 利用GenomeScope软件(Vurture et al, 2017)评估长毛对虾基因组, 大小为1 445.70 Mb, 杂合度为0.65%, 重复率为71.3%。通过SOAPdenovo2 (K=27)进行组装, 组装结果为: 长毛对虾基因组大小为1 335.76 Mb, GC含量为40.86%, N50为1 221 bp。此次长毛对虾基因组基于纯二代测序组装, 且基因组本身重复序列多, 杂合度高, 故N50长度比预期短。经BUSCO评估结果显示, 215 (21.2%)条单拷贝基因序列被覆盖, 1 (0.1%)条多拷贝被覆盖, 377 (37.2%)条基因序列覆盖不完全, 412 (41.6%)条基因序列缺失, 表明基因组组装完整性偏低, 但用于SNP标记开发已经足够。

2.2 长毛对虾SNP标记开发与过滤

采用BWA+GATK的策略对140尾长毛对虾的重测序数据进行SNP挖掘, 共获得12 579 780个原始SNP位点。按照表 1标准筛选SNP, 过滤质量值< 30、次要等位基因深度 < 3的SNP, 得到111 213个SNP。随后, 删除缺失率 > 5%的SNP, 剩余2 717个SNP; 最后, 仅保留双等位基因以及保留MAF > 0.05的SNP后, 共得到630个可用于亲子鉴定的候选位点。

2.3 长毛对虾亲子鉴定技术建立 2.3.1 次要等位基因频率(MAF)的重要性评估

根据MAF的大小, 设置三组MAF, 分别为0.05~0.20、0.20~0.35和0.35~0.50 (梯度为0.15), 每组随机挑选95个SNP位点进行亲子鉴定分析, 鉴定结果如表 2所示。在95%的置信度下, 三组SNP标记的亲子鉴定成功率随着MAF的增加而增加, 鉴定成功率从40.8%上升到81.6%, 说明在SNP个数保持不变的情况下, 亲子鉴定成功率与MAF值呈正比。

2.3.2 SNP个数的重要性评估

根据上一步得出的结论, 当MAF在0.35~0.50之间时, 亲子鉴定成功率最高。随后在此范围下形成六组SNP, 每组的SNP个数在50到300之间变化(梯度为50), 使用CERVUS分析50、100、150、200、250和300个SNP的遗传信息, 结果如表 3所示。总体来看, 随着SNP个数的增加, 基因分型比例以及各项遗传信息也随之增加。在95%的置信度下, 使用母权亲子鉴定的模型进行亲子鉴定, 鉴定结果如图 1所示。当SNP个数为50时, 亲子鉴定成功率最低, 仅为24.4%。但随着SNP数量的增加, 鉴定成功率也逐渐提高。当SNP个数达到200个时, 亲子鉴定成功率达到100%。随后, 继续增加SNP个数, 亲子鉴定成功率也没有发生改变。

2.3.3 最优SNP个数的选择

图 1显示, 当SNP个数为150时, 亲子鉴定成功率为91.8%, SNP个数为200时, 亲子鉴定成功率为100%, 因此我们在150~200个SNP的范围内寻找亲子鉴定成功率达到100%的最少SNP个数。对200个SNP的H_o值按照从小到大排序, 依次删除H_o最小的SNP位点进行亲子鉴定分析。结果显示, 当使用192个SNP位点时, 亲子鉴定成功率达到100%。因此, 本研究192个位点为最佳SNP个数。

2.3.4 遗传多样性分析

利用192个SNP标记对140个长毛对虾个体进行遗传多样性分析, 结果如表 4显示, 192个SNP标记在140个长毛对虾个体中的平均观测杂合度(H_o)为0.478, 平均期望杂合度(H_e)为0.359, 平均多态信息含量(Polymorphism information content, PIC)为0.292。

3 讨论

随着现代生物技术的发展, SNP标记已被逐渐应用于水产动物的系谱分析、亲子鉴定等研究(盖超伟等, 2021)。本研究在初步组装长毛对虾基因组的基础上, 通过基因组重测序方法开发出大量的SNP标记, 经过筛选优化最终建立了长毛对虾的亲子鉴定技术, 为长毛对虾增殖放流效果的评估提供了有效的技术手段。

本研究通过对140尾长毛对虾进行全基因组测序共开发了192个可用于亲子关系鉴定的SNP标记, 192个SNP位点的平均PIC含量为0.292, H_o平均值为0.478, H_e平均值为0.359, 根据Botstein等(1980)提出的多态性划分标准, 0.25 < PIC < 0.5为中度多态性。低于微卫星标记分析长毛对虾群体所得到的PIC值(PIC=0.690) (刘胜男等, 2019)。造成SNP标记PIC含量低于SSR标记的主要原因是由于SNP标记主要为二等位基因(刘峻宇等, 2021)。

亲子鉴定的成功率受到多种因素的影响, 即MAF、基因分型错误率和SNPs数目(Premachandra et al, 2019)。次等位基因频率(MAF)是指在特定群体中, 第二常见的等位基因出现的频率。MAF值是影响亲子鉴定效率的关键, 通常随着MAF值的增加, 亲子鉴定成功率也会随之增加(Vu et al, 2021), 在许多水产生物中都有鉴定成功率随MAF值增加而增加的相关报道。在鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)中, 选用高MAF值的SNP标记的非亲本排除概率要高于选用低MAF值的SNP标记的非亲本排除概率(Weng et al, 2021)。在大西洋鲑(Salmo salar)中, 当MAF值从0.10增加到0.40时, 亲子鉴定成功率从98.6%增加到100%; 在黄条鰤(Seriola lalandi)中, 在保持SNP个数相同的情况下, 随着MAF的增加, 亲子鉴定成功率从87.36%提高到94.58% (Dussault et al, 2018; Premachandra et al, 2019)。在本研究中, 在保持SNP数量不变的条件下, 亲子鉴定的成功率随着MAF的增加而增加, MAF值从0.05增加到0.50, 成功率从40.8%上升到81.6%, MAF在0.35~0.50时, 鉴定成功率最高, 说明亲子鉴定的成功率与MAF值呈正比, 这与上述研究结果相符。

基因分型错误率也是影响亲子鉴定成功率的原因之一, 当基因分型错误率较低时(0%~10%)对鉴定的成功率影响不大, 当基因分型错误率较高时, 亲子鉴定的成功率则会大幅降低。当有分型错误的个体分配到遗传群体中, 则有可能会影响同胞个体的亲缘关系鉴定(Wang, 2004)。通常情况下, 实验室的基因分型准确率很少超过99%, 因此我们在计算机模拟过程中, 基因分型错误率默认为1% (Kalinowski et al, 2007)。

SNP数量是影响亲子鉴定成功率另一重要因素。Weng等(2021)发现, 在鞍带石斑鱼中亲子鉴定率达到100%需要208个SNP位点。一般情况下, 随着SNP数量的增加, 亲子鉴定成功率也会增加, 直至保持不变。本研究中, 在保持MAF不变的情况下, 设置六组不同数量的SNP进行亲子鉴定分析, 结果显示亲子鉴定成功率随着SNP数量的增加而增加, 这也与珍珠贝(Pinctada maxima) (Massault et al, 2021)、鲤鱼(Cyprinus carpio) (Xu et al, 2017)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss) (Abadía-Cardoso et al, 2013)的研究结果一致。Flanagan等(2019)认为在大多数情况下, 100~500个SNP就足以解决亲子关系问题, 然而在一些物种中, 使用更少的位点数就可完成亲子鉴定。如Harney等(2018)使用60个信息含量最丰富的SNP标记在欧洲鲍螺(Haliotis tuberculata)复杂家系中实现了95%亲子鉴定成功率; 在东方牡蛎(Crassostrea virginica)中, Thongda等(2018)开发了58个SNP便达到了99.37%的亲子鉴定成功率。在本研究中, 则需要192个SNP才能在达到95%以上鉴定成功率, 用于亲子鉴定的位点数偏多, 可能与长毛对虾基因组较大、基因组的杂合度较高有关。

总之, 亲子鉴定成功率受多方面的影响, 如SNP标记的数量、质量、基因分型准确性及群体特征等(Thongda et al, 2018)。因此在建立某些物种亲子鉴定技术时, 不仅需要开发出具有多态性高的遗传标记, 也要注重提高分型、分析过程的准确性, 进而确保建立的亲子鉴定技术的可靠性。

4 结论

本研究以长毛对虾为实验材料, 通过对其进行基因组De novo测序和重测序, 初步组装了长毛对虾基因组; 在此基础上, 通过基因组重测序开发了12 579 780个SNP, 经优化, 最终建立了基于192个SNP标记的长毛对虾亲子鉴定技术, 鉴定成功率达到100%。该结果可为下一步长毛对虾增殖放流效果评估、遗传多样性分析提供参考。