大口黑鲈(Micropterus salmoides)是我国重要的淡水养殖鱼类, 因其肉质鲜美, 深受国人喜爱, 目前其在我国的年产量约为50万t, 有着“第五大家鱼”之称(Li et al, 2020)。但近年来, 随着养殖密度的不断提高以及养殖环境的恶化, 病害暴发日益严重, 严重影响了产业的发展, 目前病害已成为大口黑鲈养殖产业发展的一大瓶颈问题(Shimahara et al, 2010; Godahewa et al, 2018)。其中, 养殖阶段危害最大的是体表溃疡综合征, 其病原为大口黑鲈蛙虹彩病毒(largemouth bass virus, LMBV) (Plumb et al, 1996; Grizzle et al, 2002), 它可造成养殖阶段大口黑鲈的大量死亡, 死亡率可达70%以上。蛙虹彩病毒是一种直径120~300 nm的正二十面体病毒, 多为单分子线性双链DNA病毒, 基因组大小为l70~200 kb。大口黑鲈感染后其肝脾肾脏会出现不同程度的充血肿胀, 皮肤是大口黑鲈最易受感染的靶器官, 宿主体表通常出现大面积的溃疡, 严重时肌肉坏死形成瘘, 腹鳍处出现念珠状, 死亡率高达40%以上。

疫苗一直以来是病害防控的重要利器, 在人类以及动物的疫病防控中起着举足轻重的作用(Yao et al, 2016)。水产动物疫病研究历经一个多世纪的发展, 在我国取得了长足的进步, 但因水产动物本身的特性决定了水产动物疫苗具有注射免疫操作复杂, 容易产生应激, 免疫效果相对较差等缺点(Yao et al, 2011a)。中药因其来于自然用于自然, 具有毒性相对较低、相对绿色安全等优势, 一直以来是新药研发的热点和焦点同时, 天然产物具有结构新颖、活性成分丰富等特点, 是发现新型抗病毒药物先导物的重要来源(Yao et al, 2011b)。药物筛选的关键和核心是建立快捷、高效的药效筛选模型, 抗病毒药物的筛选模型主要有体外药效筛选模型和体内药效筛选模型, 体外药效筛选模型具有操作便捷, 实验周期较短的优点等优点; 体内模型相较于体外模型, 虽然耗时较长, 但能更全面反映药物的实际抗病毒效果。在水产动物中, 影响病毒感染模型的因素很多, 包括环境因子、鱼体本身的生理机能、病毒的毒性等。

因此, 本研究拟通过研究水温、病毒载量以及鱼体大小等这几个关键因子对大口黑鲈感染蛙虹彩病毒的影响, 进而构建体内抗病毒药效筛选模型, 结合体外药效模型, 构建大口黑鲈蛙虹彩病毒药物筛选模型, 筛选出有效的抗病毒药物中草药, 并进行抗病毒药效评价, 为大口黑鲈蛙虹彩病毒的防控提供重要的技术手段和方案。

1 材料与方法 1.1 实验材料

大口黑鲈(Micropterus salmoides)购买自湖州融晟渔业科技有限公司, 体表光滑无损伤, 经显微观察无寄生虫感染, 随机取10尾经BHI培养基分离未发现病原感染, 并经PCR检测不携带蛙虹彩病毒。

大口黑鲈蛙虹彩病毒LMBV由本实验分离鉴定, 按照常规方法在鲤鱼上皮瘤细胞上进行培养, 并经扩大培养获得100 mL的病毒培养液, 进而测定其半数细胞培养物感染量(TCID₅₀)后放置于–80 ℃冰箱中保存备用。

鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprini, EPC细胞)由浙江省淡水水产研究所实验室保存; 大口黑鲈蛙病毒LMBV-YJ株由浙江省淡水水产研究所实验室分离、鉴定和保存; 所使用的中药(表1)均购于安徽亳州中药材市场; 四唑盐(MTT)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自广州永津生物科技有限公司; QIAamp DNA Mini Kit/QIAamp RNA Mini Kit购自上海浦泉生物科技中心。

1.2 方法 1.2.1 药物的制备

将购买的中草药经粉碎后过40目筛, 并按照1︰8的比例(药物︰75%乙醇)在55 ℃的条件下, 抽提1次后, 每次3 h, 过滤后残渣按照1︰5的比例(药物︰75%乙醇)抽提2次, 合并抽提液, 旋转蒸发仪蒸至浸膏状, 再于真空干燥箱中干燥至粉末状, 4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 药物的配制

精确称取中药的干燥提取物, 溶解与DMSO中, 使其浓度为100 mg/mL, 使用时在利用灭菌的生理盐水进行稀释至所需浓度, 进行细胞实验时, 将充分溶解的药物分别过0.45、0.2以及0.1 μm的有机滤膜过滤, 同时对药液在BHI、TSA培养基以及含0.2%胎牛血清的M199培养基上进行培养以确保不含杂菌。

1.2.3 体外药效筛选试验

在进行药效之前先确定药物对细胞的毒性作用浓度。在96孔细胞培养板中加入约10⁶个EPC细胞过夜后, 加入不同浓度梯度各中药提取物, 72 h后利用MTT试剂盒测定细胞的增殖情况, 进而确定药物的安全浓度。每种药物设置5个浓度梯度, 每个浓度设置3个重复。根据药物对细胞的毒性结果选取药物进行体外药效试验: 将过滤后的药物根据设置的药物浓度与病毒液一起混匀后, 加入至事先准备好的含10⁶个EPC细胞的96孔细胞板中, 放置在28 ℃的细胞培养箱中进行培养5 d, 每天观察细胞生长情况及形态变化, 后弃去培养液, 用MTT法测定OD_490nm值, 计算细胞存活率。

1.2.4 体内模型构建 1.2.4.1 体内模型构建条件的确定

(1) 温度 根据蛙虹彩病毒病的流行病学调查情况及文献发病资料, 本实验设定温度梯度为16、19、22、25、28和31 ℃。根据温度设置5个实验组, 每组随机放置10尾大小约为20 g的鲈鱼, 每组设置3个重复。实验在控温养殖水槽中进行, 在不同温度条件下适应性养殖2周后, 进行攻毒实验, 攻毒剂量为每尾鲈鱼腹腔注射0.1 mL 10^9.33 TCID₅₀/mL蛙虹彩病毒。注射后持续观察2周, 每天于早8:30、晚5:30投喂普通饲料两次, 每天进行观察记录, 计算死亡率。

(2) 鱼体大小 考虑成本、体内实验操作的方便性并结合发病情况, 本实验共设置10、20、50和100g四个规格的鱼体, 实验共设置4组, 每组随机放置10尾不同规格的鲈鱼, 每组设置3个重复。实验在控温养殖水槽中进行, 适应性养殖1周后, 进行攻毒实验, 攻毒剂量为每尾鲈鱼腹腔注射0.1 mL 10^9.33 TCID₅₀/mL蛙虹彩病毒。注射后持续观察2周, 每天于早8:30、晚5:30投喂普通饲料两次, 每天进行观察记录, 计算死亡率。

(3) 攻毒剂量 在前期预实验结果的基础上, 设置3个攻毒剂量, 即以10^10.02、10^9.33、10^7.64 TCID₅₀/mL, 实验鱼大小为20 g左右的规格, 养殖温度为25 ℃。实验在控温养殖水槽中进行, 适应性养殖1周后, 进行攻毒实验, 攻毒剂量为每尾鲈鱼腹腔注射0.1 mL不同浓度的蛙虹彩病毒。注射后持续观察2周, 每天于早8:30、晚5:30投喂普通饲料两次, 每天进行观察记录, 计算死亡率。

1.2.5 抗蛙虹彩病毒中草药的筛选

对于制备的中草药利用体外和体内实验进行筛选, 对筛选出的具有较好抗病毒药效的中草药进行体内实验, 并进行组织病理学分析。

(1) 体外试验 同1.2.2。

(2) 体内试验 根据细胞毒性试验结果, 选取紫花地丁等8种中药进行体内抗病毒药物初筛试验, 每种药物设置2个浓度组, 每组随机放置20尾大小为20 g左右的鲈鱼, 试验温度设定为25 ℃, 试验在温度可控的循环养殖水槽内进行。各中药组投喂0.06 g/kg和0.6 g/kg饲料的提取物, 病毒组和对照组投喂基础饲料, 每天投喂2次, 时间设定为上午9点和下午16点, 实验鱼经适应性养殖2周后, 投喂药物3 d, 投喂3 d后进行攻毒, 中药组和病毒组试验鱼腹腔注射0.1 mL 10^9.33 TCID₅₀/mL的蛙虹彩病毒, 对照组腹腔注射相同剂量的生理盐水。攻毒后继续投喂药物, 并每天观察并记录实验鱼死亡情况, 连续观察14 d, 统计死亡率, 计算药物对实验鱼的保护率。

对经初筛获得的具有较好抗病毒效果的2种中药黄连和紫花地丁进行体内药效试验, 试验共设置黄连组、地丁组、病毒组和对照组, 黄连组和地丁组投喂0.3、0.6和1.2 g/kg饲料的提取物, 并按照上述的方法进行投喂和攻毒并 连续观察14 d, 统计死亡率, 计算药物对实验鱼的保护率。

(3) 体内病毒载量测定 从上一步骤的实验鱼中分别于攻毒后24、48、72 h随机取3尾实验鱼的肝脏组织进行病毒载量的测定。体内病毒载量测定利用前期实验室构建的荧光定量PCR法进行测定。

(4) 组织病理学观察 对各实验组中未死亡的鲈鱼进行组织病理学观察, 确定药物的药理作用。分别取各实验组的肝脏和肾脏组织, 用10%福尔马林固定、石蜡包埋, 经过一系列的脱水处理, 苏木精和伊红染色(H&E), 进而在显微镜下观察比较病理损伤情况。

2 结果 2.1 抗病毒药效筛选模型的构建 2.1.1 体外模型的构建

大口黑鲈蛙虹彩病毒病毒可在EPC细胞上较好地生长, 且在接毒后可观察到的明显噬斑, 见图1。同时, 使用药物后病理变化显著减少, 表明体外模型构建成功。

2.1.2 体内模型的构建

不同温度、不同个体大小的大口黑鲈对不同攻毒剂量蛙虹彩病毒的影响如图2。由图2可知: 温度和鱼体大小均可显著影响大口黑鲈的死亡率, 在本文的攻毒剂量范围内, 只有当温度高于22 ℃时方可引起大口黑鲈的死亡, 低于该温度则不会引起鲈鱼的死亡, 而25 ℃以上在5 d内死亡率可达100%。同时, 当鱼体大于100 g时, 在试验期内不会引起鲈鱼死亡, 只有在10 g和20 g这两种规格的实验鱼的死亡率可达100%。10^10.02、10^9.33、10^7.64 TCID₅₀/mL这3个攻毒结果表明, 高浓度病毒第2天即开始死亡, 且5 d内死亡可达100%, 而中浓度攻毒剂量则在第3天开始死亡, 至第8天死亡率达100%, 而低浓度组至试验结束死亡率一直维持在60%, 故而中浓度适合于药效模型的构建。对用于药物筛选的动物模型而言, 快捷、高效、低价和有效是最根本的, 因此综合而言, 20 g左右的实验鱼易于养殖、容易进行注射攻毒且价格相对低廉, 适合于药效模型的构建。故而确定体内药效模型的条件为: 25 ℃, 鱼体大小20 g左右, 攻毒剂量为腹腔注射0.1 mL 10^9.33 TCID₅₀/mL。

2.1.3 体内药效筛选模型构建

根据上述条件的模式初步确定模型条件为: 水温25 ℃, 体重大小20 g, 攻毒剂量为腹腔注射0.1 mL 10^9.33 TCID₅₀/mL。该条件下大口黑鲈从第3天开始死亡, 至第8天死亡率可达100%。病鱼出现与自然感染大口黑鲈类似的症状: 肛门红肿、鳍条基部出血、体表出血点状出血, 严重部位出现溃疡症状。组织病理学观察显示: 感染病鱼肝细胞高度肿胀, 部分细胞浆内可见大量圆形空泡; 肾小球肥大细胞核缩、碎裂, 严重空泡化, 胞浆呈丝网状(图3)。

2.2 药物筛选结果 2.2.1 体外筛选

柴胡等29种中草药对EPC细胞的安全性实验结果如表2, 由表2可知, 博落回等15种中草药对EPC细胞具有一定的毒性作用, 其浓度为1×10^–2 g/mL时, 细胞存活率在65%以下, 而黄连、紫花地丁等药物对EPC细胞的毒性相对较低, 其浓度为1×10^–1 g/mL, 细胞的存活率在95%以上。

因博落回等15种药物对细胞的毒性较大, 因此我们选择黄连、紫花地丁等14种药物毒性较低的进行抗病毒体外药效评价, 体外抗病毒药效结果如表3。由表3可知, 黄连、紫花地丁等药物具有较好的抗病毒作用, 体外抗病毒效果最好的是黄连, 其最高浓度细胞的存活率可达96.88%, 其次是败酱草和紫花地丁, 其最高浓度的细胞的存活率仍可达96.36%和96.28% (表3)。

2.2.2 体内抗病毒药物初筛

对体外抗病毒效果较好的黄连等8种中药进行第一次体内抗病毒药效评价, 其结果如图4, 黄连、紫花地丁、板蓝根、蒲公英和马鳖草等药物对大口黑鲈均具有一定的保护作用, 且存在一定的浓度依赖关系, 对照组在攻毒后第3天即开始死亡, 至第8天时死亡率为100%, 而黄连组和紫花地丁组在第5天时才发生死亡, 而到第12天之后即不再发生死亡。当投喂浓度为0.6 g/kg时, 黄连和紫花地丁对大口黑鲈的最高保护率均达40%。

2.2.3 黄连和紫花地丁抗病毒药效评价

对初筛选中效果最好的黄连和紫花地丁, 以0.3、0.6和1.2 g/kg的剂量进行投喂, 其体内抗病毒药效评价如图5。由图5可知, 黄连和紫花地丁对大口黑鲈均具有一定的保护作用, 其浓度为0.6 g/kg和1.2 g/kg时, 黄连和地丁的保护率最高均达到40%。

2.2.4 体内病毒含量测定

黄连组和紫花地丁组肝组织的病毒载量测定结果如图6: 口服黄连和紫花地丁对蛙虹彩病毒具有显著的抑制效果, 且存在着时间依赖关系, 同时, 黄连的抑制效果优于紫花地丁, 黄连组最高抑制率可达70.5%, 而紫花地丁最高抑制率可达67.1%。

2.2.5 组织病理学观察

通过肝脏和脾脏的组织病理学切片(图7)可看出: 相对于空白对照的肝细胞, 病毒对照组有小区片状的肝细胞坏死(黄色箭头)片状细胞消失, 且有炎细胞浸润(红色箭头)间质纤维组织增生和色素沉淀(黑色箭头); 黄连组仅出现肝细胞轻度水肿和极少边缘处点状坏死; 紫花地丁组也仅有间质肝细胞轻度浊肿。同样比较与于空白对照的脾细胞, 病毒对照组出现了大片的淋巴细胞减少, 未见明显淋巴小结, 且有较多的炎症细胞浸润; 黄连组仅有间质炎症细胞浸润, 紫花地丁组细胞状态与空白对照组一致。由此可看出两组药物均起到了对病毒的抑制作用。

3 讨论

大口黑鲈是我国的重要名优鱼类, 在我国的水产养殖中占有重要的地位, 但近年来不断暴发的病毒病给该产业造成了巨大的经济损伤, 也成为了现在大口黑鲈养殖发展的一大瓶颈, 尤其是蛙虹彩病毒病给整个大口黑鲈的养殖产业带来了巨大的经济损伤。目前对该病防治的研究主要集中在检测和疫苗研制方面, 但目前还未有生产文号的药物可使用, 因此迫切需要有效的药物, 本研究通过构建体外和体内药物筛选模型, 从29种中药中筛选获得黄连和紫花地丁这2种对大口黑鲈蛙虹彩病毒具有一定效果的中草药, 其体内保护率可达40%, 具有一定的开发前景。

病害的暴发与环境密切关联, 温度是影响病毒感染的重要影响因素和限制因子, 也是构建体内抗病毒药效模型的重要因素。于新然(2019)对鲤疱疹病毒Ⅱ型致病性及其对异育银鲫温度敏感特性的研究表明, 当温度低于10 ℃时, 即使感染也不发生死亡, 而只有温度高于20 ℃才会导致大规模的死亡。而鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的暴发同样与温度存在显著的关联, 其在20 ℃以下不发病, 而28~30 ℃是其最佳发病温度(曾慷等, 1999)。本研究结果显示, 蛙虹彩病毒在22 ℃以下几乎不会造成死亡, 提示蛙虹彩病毒是一种高温病毒病, 这与目前该病的流行病学调查结果是一致的, 同时结果也显示在实际生产中尤其是在温室苗种培育可通过降低温度来提高育种的成功率。鱼体大小对病毒感染也存在显著的影响, 雷燕(2015)研究发现大口黑鲈弹状病毒一般仅在鲈鱼苗种时期会导致大量的死亡, 而对于成鱼即使感染也不会导致死亡。本研究结果显示鱼体在100 g以上时不会造成鱼体的死亡, 这与实际生产中有一定的差异性, 这可能是因为影响虹彩病毒对鲈鱼致死的因素不仅仅是温度, 还可能与其他环境条件、病毒毒力以及感染时间等均有一定的相关性, 但具体机制还需要进一步研究。本研究构建的体内药效评价模型被证实可行、可靠的。

黄连又称味连、川连等, 是毛茛科植物黄连、三角叶黄连或云连的干燥根茎, 它是我国一种常用的中草药, 具有降血糖(王新征等, 2021)、抗糖尿病(郑雨加等, 2021)、抗菌(蒋丽施等, 2021)、治疗消化系统疾病(李海元等, 2020)、抗炎和抗病毒(马国琴等, 2019)等方面的作用。本研究结果显示黄连提取物具有较好的抗蛙虹彩病毒的作用, 这是首次研究黄连对水产动物病毒性疾病的药效研究, 国内外研究表明黄连流感病毒、单纯孢疹病毒等均具有一定的作用, 且黄连提取物黄连素通过对病毒RNA聚合酶活性的抑制作用而达到抗病毒的治疗作用(马国琴等, 2019)。

紫花地丁又称紫堇, 是堇莱科(Violaceae)植物紫花地丁的全草, 具有抗炎(李金艳等, 2008)、抑菌(李永生等, 2013)、清热解毒、抗病毒和抗肿瘤(崔雪等, 2020)等作用。其化学成分主要为黄酮、生物碱、香豆素、甾体类、酰胺类、萜类和环肽类等, 其中目前报道的从紫花地丁中分离出来的具有生物活性的单体物质主要有木犀草素、芹菜素、槲皮素、7, 8-二甲氧基香豆素、咖啡酸以及奎宁酸等物质。目前对紫花地丁抗病毒作用的研究较多, 其主要对传染性支气管炎病毒、呼吸道合胞病毒、抗鸡新城疫病毒、流行性感冒病毒、丙型肝炎病毒以及猴免疫缺陷病毒具有一定的作用, 其抗病毒的主要活性成分有木犀草素、cycloviolacin VY1 (环紫素VY1)等(崔雪等, 2020)。本研究初步确定了黄连和紫花地丁具有较好的抗蛙虹彩病毒的作用, 但其抗病毒主要活性成分还需要进一步研究, 这对于将来开发抗病毒先导化合物以及抗病毒药物的合成均具有较好的意义。

4 结论

本实验通过研究水温及鱼体大小等条件, 确定了大口黑鲈抗蛙虹彩病毒药物筛选模型条件的水温、鱼体大小及攻毒剂量。结合体内和体外药效筛选模型, 筛选出紫花地丁和黄连这两种对大口黑鲈蛙虹彩病毒具有较好作用的中药。当两者的添加量为0.6 g/kg时, 其保护率可达40%, 且用药后对大口黑鲈肝组织病毒有着较高的抑制率。紫花地丁和黄连具有开发抗蛙虹彩病毒植物源药物的潜力和前景, 有望在我国鱼类产业健康养殖中起到重要作用。