随着塑料制品产量的增加, 几乎全球海洋都存在塑料污染的问题(Dauvergne, 2018)。据统计, 全球每年排放到海洋中的塑料垃圾大约有800万t, 共生产微塑料垃圾大约150万t (Lau et al, 2020)。微塑料是指直径小于5 mm的塑料碎片(杨璐等, 2018), 在海洋中以分布范围广(李道季, 2019)、降解速度慢(扈瀚文等, 2020)和毒理性复杂(马乃龙等, 2018)为特点。微塑料污染在海洋食物网的各个营养级中均有发现, 被证实存在于多种海洋生物中(Kim et al, 2017; 武芳竹等, 2019), 已经成为全球海洋环境研究的一个热点。鸢乌贼Sthenoteuthis oualaniensis隶属头足纲(Cephalopoda)、柔鱼科(Ommastrephidae)、鸢乌贼属(Sthenoteuthis), 为暖水大洋性头足类(王尧耕等, 2005), 广泛分布于太平洋的热带及亚热带、西北印度洋、南海等海域(陈新军等, 2013; 陆化杰等, 2014), 具有较高的资源储量(张鹏等, 2010)。此外, 鸢乌贼作为南海的重要经济头足类(张鹏等, 2010), 在当地海洋生态系统中也处于关键种的地位(谢嘉仪等, 2021), 国内外学者已对其渔业生物学(朱凯等, 2020; 陆化杰等, 2021a)、硬组织(陆化杰等, 2020a; 陆化杰等, 2020b)、年龄生长(招春旭等, 2021)、渔情预报(谢恩阁, 2020)等进行了研究, 但有关头足类微塑料的研究相对较少(陆化杰等, 2021b), 而针对南海鸢乌贼微塑料沉积特性的研究更是尚未见报道。鉴于此, 本文根据中国生产调查船2020年3~5月在南海西沙群岛海域采集的鸢乌贼样本, 对其胃组织微塑料的沉积特性进行了研究, 分析其胃组织微塑料含量与其生物学信息(胴长, 体重, 年龄, 摄食强度和胃重)的关系, 并对胃组织中微塑料的积聚趋势进行推测, 为进一步了解头足类对微塑料的摄取特性以及微塑料对头足类生存、繁殖等影响研究提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 采样时间和海域

采样海域位于南海西沙群岛海域, 采样时间2020年3月3日~5月29日。调查海域为16°35′~18°12′N、109°37′~112°23′E (图 1)。每天从渔获物中随机抽取鸢乌贼样本20~30尾, 记录站点并冷冻保存, 整个调查期间共采集鸢乌贼样本836尾。调查渔船为海南省三亚榆丰渔业公司所属的灯光罩网渔船“琼三亚72057”。

1.2 生物学及胃组织采样

综合考虑采样时间(尽可能长时间序列), 样本个体大小(尽量包含不同规格大小的样本)、采样空间范围(尽可能涵盖全部的采样海域)和样本年龄分布(尽可能涵盖不同年龄段个体), 从采集的836尾鸢乌贼样本中选取36尾鸢乌贼样本进行微塑料研究, 并对其胴长(mantle length, ML)、体重(body weight, BW)、性别和摄食强度等渔业生物学数据进行测量和鉴定, 在此过程中长度精确至1 mm, 重量精确至1 g, 性成熟度划分参照头足类的性成熟度分期标准(木所英昭等, 2016), 摄食强度采用5级标准(加賀敏樹等, 2016)。获取生物学数据后, 将鸢乌贼进行解剖, 对其胃组织取出称重(精确至0.1 g)后放入广口玻璃瓶中冷冻保存(在此过程中应注意解剖前用超纯水洗净双手以及实验仪器)。

1.3 微塑料测定

将选取的胃组织样本在干净、无污染的环境下进行解冻、消解、抽滤、静置干燥、显微镜挑选、微塑料测定等一系列操作。具体如下:

1.3.1 消解

将采集的胃组织样本放入预先清洗(自来水清洗干净后用超纯水冲洗2~3遍)的250 mL的玻璃烧瓶中, 加入80~100 mL 30%的过氧化氢溶液后用锡纸将瓶口盖住, 以防污染和溶液溅出。将封口后的烧瓶放入HZ-9612K恒温振荡器中保持温度65 ℃, 80 r/min, 放置72 h (Cai et al, 2019)。

1.3.2 抽滤

将消解后的组织溶液用型号GM-1.0A, 功率160 W, 抽气速度60 L/min, 极限压力0.08 Mpa的隔膜真空泵组合过滤仪器进行抽滤。滤膜型号为Millipore Nylon NY2004700。每一胃组织样本过滤完成后, 将实验仪器用自来水清洗干净后再用超纯水冲洗2~3遍方可进行过滤(Cai et al, 2019)。

1.3.3 静置干燥

每一次过滤完成后, 将滤膜取出, 放入干净无污染的有盖培养皿中, 放置于无风温暖干燥处静置干燥(Cai et al, 2019)。

1.3.4 显微镜观察挑选

滤膜干燥完成后在蔡司显微镜(Carl Zeiss Discovery V8 Stereo)下进行对滤渣的挑选, 利用AxioCam数字摄像机进行图像显示。将疑似微塑料挑出有顺序置于有标号的卡片纸上。每一个组织样本挑选完成后, 利用AxioCam数字摄像机进行疑似微塑料图像的摄取, 并记录放大倍数。疑似微塑料挑选过程中尽量在无风条件下进行, 及时将培养皿盖住, 以防在挑选过程中的外界干扰和污染(Yang et al, 2015)。

1.3.5 微塑料测定

把卡片纸上已经挑出的疑似微塑料用Micro-FTIR (Nicolet iN 10, Thermo Fisher, USA)进行微塑料的鉴定, 匹配标准为匹配度达到70%以上。将鉴定结果是微塑料的样本对其种类和数量进行分类记录, 并记录颜色, 为之后分析做准备。微塑料测定完成后, 利用ImageJ (×64)图片处理软件对其进行长度测量(Yang et al, 2015; Cai et al, 2019)。

1.4 年龄获取

样本年龄通过鸢乌贼耳石微结构获取, 耳石研磨参照陆化杰(2012)的方法进行, 研磨成功后的鸢乌贼耳石微结构如图 2所示。研磨成功后, 按照根据生长纹的宽度和清晰程度依次从由核心到侧区, 再由侧区到背区读取轮纹个数, 并按照耳石生长一轮为1 d的假设, 以此读取耳石的年龄(陆化杰等, 2020a)。计数过程中, 每一个耳石的轮纹计数需2人各计一次, 每人计数的轮纹数目与均值的差值低于5%, 则认为计数准确, 否则再计数2次取4次平均值(陆化杰等, 2012)。

1.5 统计分析

(1) 按照微塑料的数量、材质、颜色、尺寸对南海西沙群岛海域鸢乌贼胃组织中微塑料沉积特性进行统计分析(Zhang et al, 2020)。

(2) 利用皮尔逊相关性分析(0.01级别, 双尾)研究胃组织中微塑料摄取数量和个体大小(胴长和体重)、年龄、胃重、摄食等级之间的相关性(Su et al, 2019b)。

(3) 按照胃组织中微塑料含量个数对样本进行分组, 计算每组所有样本的胴长、体重、年龄的平均值(牛献礼, 2017)。

(4) 利用最小二乘法拟合胃组织微塑料摄取数量与相同微塑料含量样本的平均胴长、平均体重和平均年龄的关系(陆化杰等, 2012)。

整个数据处理和图形制作在Microsoft Office Excel 2016和SPSS 20软件进行。

2 结果 2.1 生物学信息

鸢乌贼样本胴长范围为63~170 mm, 平均胴长为118.1 mm; 体重范围为17~174 g, 平均体重为78.6 g; 胃重范围为0.38~8.56 g, 平均胃重为2.46 g; 摄食强度范围为1~4级, 分布较为均匀。

2.2 胃组织中微塑料的特征

研究结果显示, 在36尾鸢乌贼中有33尾(91.67%)胃组织中发现了微塑料, 数量共计88个, 单个样本微塑料含量介于0~6个, 多数集中于1~2个, 最多为6个, 平均为2.44个。鸢乌贼胃组织微塑料形状绝大多数为纤维状, 仅发现3个球状以及1个薄膜状样本(图 3)。微塑料长度范围为0.121~2.748 mm, 平均长度为0.878 mm, 其中75.0%的微塑料尺寸小于1 mm (图 4a), 其余尺寸均介于1~3 mm (图 4a)。颜色包括黑、蓝、透明、白、红、黄6种, 其中黑色和蓝色所占比例较高, 为39.8%和31.8%, 其他4种颜色(透明、白、红、黄)依次占比分别为10.2%、6.8%、6.8%和4.6% (图 4b)。微塑料材质主要为棉(cotton)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate PET)、人造丝(rayon)、聚酯纤维(polyester)、聚苯乙烯泡沫塑料(styrofoam)、聚乙烯(PE)和丙烯酸塑料(acrylic) 7种, 占比分别为50%、21.6%、10.2%、9.1%、4.5%、2.3%和2.3% (图 4c)。

2.3 胃组织中微塑料含量与胃重和摄食强度之间关系

相关性分析表明, 南海鸢乌贼胃组织微塑料含量与胃重(r=0.302)、摄食强度(r=0.289)不存在显著相关性。

2.4 胃组织中微塑料含量与胴长、体重之间关系

相关性分析表明, 南海鸢乌贼胃组织微塑料含量与胴长间存在显著相关性(r=0.742)。由于胃组织样本中微塑料含量范围为0~6个/尾, 以微塑料含量为标准将其分为7组(微塑料含量分别为0、1、2、3、4、5、6个的所有鸢乌贼胴长为1组), 并求出每组的平均胴长。经拟合, 微塑料含量与平均胴长呈线性关系(图 5a)。

式中, x为平均胴长; y为微塑料含量。

相关性分析表明, 南海鸢乌贼胃组织微塑料含量与体重间存在显著相关性(r=0.782)。同胴长分组一样, 按微塑料含量个数将其分为7组(微塑料含量分别为0、1、2、3、4、5、6个的所有鸢乌贼体重为1组), 求出每组平均体重。经拟合, 微塑料含量与平均体重也呈线性关系(图 5b)。

式中, x为平均体重; y为微塑料含量。

2.5 胃组织中微塑料含量与年龄之间关系

相关性分析表明, 南海鸢乌贼胃组织微塑料含量与年龄之间也存在显著相关性(r=0.754)。相同道理, 以微塑料含量为标准将其分为7组, 并求出每组样本的平均年龄。经拟合, 微塑料含量与平均年龄也呈线性关系(图 6)。

式中, x为平均年龄; y为微塑料含量。

3 讨论 3.1 微塑料含量分布特性

本研究显示, 36尾南海鸢乌贼样本中有33尾胃组织中发现了微塑料, 所占比例为91.67%, 微塑料数量为88个, 平均含量为2.44个/尾。Gong等(2021)在对同为柔鱼科的茎柔鱼Dosidicus gigas微塑料摄入的研究中发现, 83.33%的胃组织样本中含有微塑料, 平均丰度为(7.42±4.88) 个/尾。相比于南海鸢乌贼, 生活在大洋的茎柔鱼也有较高的微塑料摄取量, 其可能原因是茎柔鱼属于高度洄游物种, 生活海域较广(Stewart et al, 2013; 陆化杰等, 2021b), 还可能由于茎柔鱼食物来源范围广, 包括大洋性、底栖性鱼类, 头足类, 甲壳类, 而这食物组成也会对其胃组织微塑料沉积产生一定影响(Alegre et al, 2014; Gong et al, 2020; 陆化杰等, 2021b)。本研究所发现的微塑料尺寸上大部分小于1 mm (74.4%), 这与Gong等(2021)、Zhang等(2019, 2020)研究结果相似。本研究共发现6种颜色的微塑料, 其中以黑色、蓝色为主, 与其他相关微塑料研究在颜色相似, 但所占比例略有不同, 可能反映不同海域微塑料分布特性不同(陆化杰等, 2021b; Gong et al, 2021)。

本研究发现, 鸢乌贼胃组织微塑料形状为常见的纤维状、球状和薄膜状, 材质主要有cotton (50.0%)、PET (21.6%)、rayon (10.2%)、polyester (9.1%)、styrofoam (4.5%)和PE (2.3%)、acrylic (2.3%) 7种材质。与本研究相比, Gong等(2021)通过对茎柔鱼组织的研究, 仅发现2种相同材质微塑料(PET, acrylic)和3种不同材质微塑料(玻璃纸cellophane, 醇酸树脂alkyd, 聚丙烯polypropylene), 这可能由于不同材质微塑料在海洋环境中的分布特点不同导致(Jabeen et al, 2017; 武芳竹等, 2019), 也可能与这两种头足类的栖息环境(王尧耕等, 2005)不同有关。对比Zhang等(2019, 2020)、Su等(2019a)和Neves等(2015)、Rummel等(2016)的研究发现, 本研究中微塑料测定结果显示出cotton材质微塑料占有比例稍高, 具体原因后续还要深入研究。

3.2 胃组织中微塑料含量与胃重、摄食等级及胴长、体重、年龄间关系

本研究显示, 南海鸢乌贼胃组织样本中微塑料含量与胃重、摄食强度间不存在显著相关性。木所英昭等(2016)和加賀敏樹等(2016)的研究表明, 胃重只能反映整个胃的实际重量, 摄食强度则是反映了胃的饱满程度, 胃重和摄食等级会根据摄食情况产生变化, 具有瞬时性, 由此推测胃组织中微塑料的积聚并非瞬间摄食决定, 因此胃含物的重量和摄食强度不能用于推断微塑料的摄取量。本研究还表明, 南海鸢乌贼胃组织中微塑料含量与平均胴长、体重和年龄具有显著的正相关性。国内外学者曾对微塑料在鱼类体内的富集特性开展了研究, 结果显示, 个体体长和体重相对较大的鱼类其体内微塑料含量要明显高于尺寸较小的鱼类(Su et al, 2019b); 还有研究表明微塑料在鱼类体内的聚集与体长、体重呈明显的正相关关系(Huang et al, 2020), 这与本研究相关性研究结果基本一致。

本研究表明南海鸢乌贼胃组织中微塑料的含量和平均年龄也呈现显著正相关性, 即随着年龄的增长, 南海鸢乌贼胃组织中微塑料含量也会随之增长。由此推测, 南海鸢乌贼对微塑料的摄取是长期积聚而成, 但是, 这种积聚是否存在饱和点, 达到饱和点后不再摄入, 还是在体内达到一定沉积量时保持摄入和排出的动态平衡, 由于本研究的样本特性所限, 尚不得而知, 这可能也是胃组织中微塑料含量与平均胴长、体重和年龄之间均呈线性关系的原因。因此, 本研究推测当样本量以及样本大小在理想条件下, 胃组织中微塑料含量与胴长、体重和年龄之间应呈现出对数函数(a > 1)关系, 这将是今后研究的关注点之一。虽然尚未有太多研究证明头足类胃组织微塑料含量与年龄与之间的正相关关系, 但陆化杰等(2012)在对头足类年龄生长的研究中证明, 头足类胴长、体重与年龄存在显著正相关关系, 这也侧面支撑了本研究结果的可靠性。本文拟合了胃组织中微塑料含量与平均胴长、体重和年龄之间的曲线, 尤其是拟合了微塑料含量与平均年龄的曲线, 填补了相关空白。

4 结论与展望

本文对南海鸢乌贼胃组织样本中微塑料的含量、尺寸、形状、颜色和材质, 以及所占比例进行了比较全面的研究, 对南海鸢乌贼胃含物中微塑料含量与平均胴长、体重、年龄间相关性进行分析, 并建立了曲线方程, 弥补了相关空白。目前为止, 头足类体内微塑料的研究相对较少(陆化杰等, 2021b; Gong et al, 2021), 而对于微塑料含量与头足类胴长、体重之间关系的研究更是少见, 今后研究应对微塑料在头足类甚至鱼类体内的积聚呈现出a > 1的对数函数关系的推测进行验证。同时, 由于研究样本通过金属钓具获取, 在样本初始来源上避免了塑料污染, 虽然在冷冻运输过程中用塑料袋包装, 但课题组在实际挑选样本过程中摈弃了直接与塑料袋子直接接触的边缘样本, 同时研究对象为鸢乌贼的胃组织, 而胃组织本身置于鸢乌贼身体内部, 已经最大程度降低了采样过程中的塑料污染问题。

此外, 研究证实微塑料对人体肠道上皮、黏膜层等肠道环境产生危害(Huang et al, 2021), 并且微塑料浓度变化与细胞死亡发生率相似(Yarbakht et al, 2021), 而鸢乌贼作为南海重要经济头足类(张鹏等, 2010), 扮演着海产蛋白和养殖饲料的重要角色, 其体内微塑料是否会随着食物链最终流入人体中以及流入人体的转化率, 目前还不得而知, 还需要后续深入研究。另外, 本文仅研究了南海鸢乌贼胃含物中的微塑料, 其他组织例如鳃、消化腺、肌肉等是否存在微塑料, 以及其他头足类对微塑料的摄取特性和头足类摄取微塑料后生长发育受到哪些影响, 还需进一步研究。