带鱼(Trichiurus lepturus)又名牙带鱼, 其风味鲜美、营养物质种类丰富, 蛋白质高, 易被人体吸收, 深受大众喜爱(杨胜平, 2010)。带鱼肉质银白细嫩, 富含人体所必需的多种营养元素, 而且还可以预防血压较高、动脉狭窄、癌症等疾病的发生(贺莹, 2019)。通常来说带鱼采用低温条件进行运输和贮藏, 并且在这期间易受微生物和内源性蛋白酶的影响, 易产生一些胺类和醛类物质, 导致鱼肉发生腐败, 使带鱼体表颜色发生变化, 引起品质劣变, 而导致鱼肉腐败的一部分原因就是由于微生物的作用(沈妮, 2019)。

在微生物腐败菌的分离培养鉴定等方法中如实时定量荧光聚合酶链式反应、多重聚合酶链式反应等在检测过程中会受到多重因素的干扰, 容易造成错误判定, 而高通量测序技术能够更完美、准确反映样品中微生物菌群分布, 可以同时完成对测定微生物基因分子的序列测定, 更精准、全面地鉴定样品中微生物的单一或全面基因组(Di Bella et al, 2013)。除此之外, Miseq技术在测序过程中无需大量PCR扩增, 实现准确、快速、全面的测序及多样性分析(徐鹏昊, 2016; 张国林等, 2021)。而一些优势腐败菌如希瓦氏菌属、嗜冷菌属等是传统分离鉴定方法难以对群落结构进行全面分析的。

低压静电场保鲜是一种物理保鲜方法, 通过控制水分子偶极振动减少水的相变时间, 冰晶粗糙度均匀并重新排列形成的小冰晶, 使蛋白质结构得以完整保留, 食物的口感和咀嚼性得到提升, 其次就是降低细胞呼吸速率(Xie et al, 2021), 外部电场还可以改变水分子与活性酶的结合态, 导致酶的活性降低甚至没有活性, 在电场反应下, 空气被电离产生臭氧和负离子, 臭氧能直接氧化并破坏细菌的细胞壁和细胞质膜, 然后进入细胞并作用于其DNA (丹阳等, 2004; Xanthakis et al, 2013)。

因此, 本研究基于高通量测序技术, 研究低压静电场对贮藏至40 d带鱼保鲜过程中微生物组成差异情况, 旨在为保鲜中菌群组成及低压静电保鲜技术提供基础信息(毛俊龙等, 2020)。

1 材料与方法 1.1 试验材料

新鲜舟山带鱼(Trichiurus lepturus)采购自舟山沈家门渔港, 体长约0.8~1.0 m, 厚约2~3 cm, 带鱼通体银白铮亮, 鱼眼小且透明, 鱼皮湿滑, 无破损品质完好, 经过处理后进行包装袋包装, 设定温度为-4 ℃, 分别进行电场保存。

1.2 试验试剂

本试验所用试剂包括AS132 DNA提取试剂盒、Qubit3.0 DNA试剂盒、Hieff NGS^TM DNA分选磁株等, 具体见表 1所示。

1.3 仪器与设备

本试验所用仪器与设备包括恒温振荡器、电场板、PCR检测仪等, 具体见表 2所示。

1.4 方法 1.4.1 样品处理

取同一批次的新鲜带鱼为试验原料, 运送至实验室后进行清洗、分装。

对照组(CK): 将带鱼放入无电场的环境下, 微冻–4 ℃进行保鲜试验, 标记样品为DY1。

实验组(LVEF): 将带鱼样品放入低压静电场, 微冻–4 ℃下进行持续三种电场强度(2, 2.5, 3 kV/m)处理, 标记样品为(DY2, DY3, DY4), 电场频率为50 Hz。

1.4.2 带鱼微生物的提取

将贮藏至40 d的四组带鱼样品进行研磨搅碎后取10 g带鱼样品, 加入9倍体积的生理盐水, 之后进行离心分离(12 500 r/min, 10 min), 取菌体沉淀物进行微生物菌群研究, 每组样品进行三次平行实验(Hu et al, 2015; Li et al, 2020)。

1.4.3 总DNA的提取

参考廖娟等(2020)的方法。使用无菌枪头刮取表面菌落, 转移适量样品至2 mL样品管中进行提取。Qubit定量检测DNA样本浓度。DY1、DY2、DY3、DY4点样浓度分别为48.6、51.2、53.6、66.2 ng/μL, 上样量400 ng, DNA提取电泳如图 1所示。

1.4.4 PCR扩增

将PCR管置于PCR仪中进行扩大范围递增, 第一轮PCR作用条件: 94 ℃预变性3 min; (94 ℃变性30 s → 45 ℃退火20 s → 65 ℃延伸30 s) 5个循环; (94 ℃预变性20 s → 55 ℃退火20 s → 72 ℃延伸30 s) 20个循环; 72 ℃再延伸5 min, 10 ℃保存。第二轮引入桥式PCR兼容引物, 27F、1492R为通用引物, 将PCR管置于PCR仪中进行扩大, PCR反应条件: 95 ℃预变性3 min; (94 ℃变性20 s→ 55 ℃退火20 s → 72 ℃延伸30 s) 5个循环; 72 ℃再延伸5 min, 10 ℃保存。PCR扩增电泳如图 2所示(张皖君, 2018)。

1.4.5 MiSeq测序

为了得到均匀的长簇效果和高质量的测序数据, 使用Qubit 4.0荧光定量系统进行文库浓度的定量测定。文库经完整性查验后送往上海生工生物公司进行Illumina MiSeq测序(郭倩倩等, 2019)。

1.4.6 菌群生物信息学分析

采用cutadapt、PEAR、PRINSEQ、RDP classifier、GraPhlAn等软件分析微生物群落生物信息。

2 结果与讨论 2.1 OTU聚类

MiSeq测序过程中会产生数以万计的16S序列, 逐一进行物种标注耗时太长, 且第二代测序在经PCR扩增后会发生碱基错配的概率会大大提升, 故引入OTU聚类, 且后续微生物信息学分析都是OTU聚类结果展开的。OTU (Operational Taxonomic Units)是在遗传生物学和统计系统学研究中, 为方便分析而人为对微生物菌群分类添加的标志。通常所有样本去除冗余序列合并, 去除没有重复的单序列, 相似度95%以下认为不同属, 相似度97%以下可以认为测序微生物不同种, 一般采用Usearch作OTU聚类(Edgar, 2013)。

由表 3可知, 带鱼样本的有效序列信息, DY1、DY2、DY3、DY4的碱基信息分别是CGTATC、AGCAGT、GAGGAA、CGAGTC, 有效序列条数分别为88 714、84 447、83 544、74 711, 碱基数分别为38 137 408、36 304 277、35 919 079、32 124 163, 序列平均长度大致相同。差异说明电场强度与检出有效序列条数、碱基数呈负相关。

表 4列出了各电场所有优化序列参数对应的OTU代表的序列阈值数, 选出与对应代表序列相似性在97%以上的序列OTU名称, 可以看出各个组间样品OTU类别和序列数不尽相同, 需要结合表 5的OTU物种注释分析。OTU物种注释表明, 带鱼贮藏过程中体内微生物群落全部由细菌群组成, 并没有产生真菌群落。在门水平上, 变形菌门(Proteobacteria)为优势菌门, 仅有OTU3聚类为厚壁菌门(Firmicutes)。在纲水平上, 丙型变形菌纲(Gammaproteobacteria)为优势菌纲, 丙型变形菌纲分布广泛, 各组样品均有OTU聚类。在目水平上, 假单胞菌目(Pseudomonadales)聚类水平较高。在科水平表现出了较高的丰度, 聚类结果为希瓦氏菌科(Shewanellaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、李斯特菌科(Listeriaceae)、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、鞘脂杆菌科(Sphingobacteriaceae)。属水平是Miseq测序OTU分类信息学Usearch分析的最小单位(Caporaso et al, 2012), 能较客观地描述该菌的生理特征和作用, 可以用于腐败原因分析, 本次Miseq测序的OTU聚类属主要有希瓦氏菌属(Shewanella)、节杆菌属(Arthrobacter)、柄杆菌属(Caulobacter)、工地杆菌属(Pedobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、索丝菌属(Brochothrix)、嗜冷菌属(Psychrobacter)、紫色杆菌属(Janthinobacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter) (曹荣等, 2016)。

2.2 多样性分析

Miseq测序后的OTU聚类能够表征微生物群落的具体信息, 但仅靠OTU聚类的分析仍不够全面, 还需要结合Mothur和R软件对OTU菌属做多样性分析(Lu et al, 2014)。

表 6列出了DY1、DY2、DY3、DY4的Alpha多样性指数。在97%的OTU聚类水平上, 微生物丰度指数Chao和Ace越大, 样本丰度指数越高(杨春敏等, 2019); 微生物菌群的多样性指数Shannon越大, 样本多样性越高, Simple指数趋势则与Shannon相反(Gong et al, 2019)。可以看出四组样品Chao和Ace丰度指数大小排序为DY1 > DY2 > DY3 > DY4, Shannon多样性指数大小排序与Chao和Ace相同, Simple则相反。样本文库覆盖率均为1, 各样本测序可信度高。

图 3列出了OTU聚类微生物的属级相对丰度, 不同颜色区块代表各菌属所占样本的百分比。DY1、DY2、DY3、DY4中相对丰度最高的是假单胞菌属a, 分别占了OTU总量的61%、76%、87%、97%。对照组DY1颜色区块最多, 有多个独有OTU聚类菌属, 其中希瓦氏菌属(31%)、假单胞菌属的恶臭假单胞菌(4%)、紫色杆菌属(1%)是水产品主要致腐菌(曹荣等, 2019)。电场处理组DY2、DY3、DY4也有多个独有菌属, 经分析均无强致腐性和致病性, 说明电场能够有效抑制带鱼贮藏过程中腐败菌的生长, 这与段伟文(2019)的结论相同。DY4微生物群落丰度最小, 表现为嗜冷菌属(0.1%)、假单胞菌属c (0%)的相对丰度较少。DY4在40 d时OTU6嗜冷菌属和OTU13假单胞菌属c的相对丰度均小于1%, 还有OTU7、OTU14、OTU8、OTU9等菌属未被OTU聚类。说明3 kV/m电场强度的低压静电场抑菌保鲜效果最好, DY2、DY3次之, DY1效果最差。印证了前文中贮藏理化特性、蛋白质特性和水分迁移情况的数据。

Alpha稀释性曲线图变化情况如图 4所示, 横轴代表多样性分析抽取的数据量, 纵轴代表Alpha指数, 根据曲线是否能达到平缓来判断Miseq测序数据量的充分性。从曲线趋平程度来看, Alpha稀释性曲线中DY1 > DY2 > DY3 > DY4, DY4最先趋平, DY3、DY2次之, DY1直至最后仍未趋平。说明DY1贮藏过程中杂菌种类多, 样本微生物群落物种丰度和多样性均高于电场组, 腐败程度也最大。电场处理组DY2、DY3、DY4也有多个独有菌属, 但均无致腐性和致病性。

样本共线性关系如图 5所示。以门水平为标准, 右弧表征微生物群落物种组成情况, 左弧表征微生物群落的分布比例情况, 一个颜色代表一个物种, 长度代表丰度比例, 第三圈的彩色区带一角连接样本, 另一角连接物种, 区带宽度代表具体物种丰度。样本门中96.82%为变形菌门(Proteobacteria), 仅有2.81%厚壁菌门(Firmicutes), 其他菌门占比均小于1%。

2.3 相关性分析

组间相关性是检验实验可靠性和样本合理性的重要标准, R²越接近1, 表示关联性越好。由图 6可知, DY4与DY3、DY2、DY1相关系数分别为0.72、0.67、0.49, 相关程度逐渐缩小。DY3与DY2、DY1相关系数分别为0.45、–0.07, 相关性不强。DY2与DY1相关性仅为0.32。DY4、DY3、DY2与对照组DY1主成分差异显著(P < 0.05), DY4与DY3样本最相似(P > 0.05)。表明了在四组电场中DY4与DY3的关联密切程度最好, 而与DY1呈极度不相关。

图 7为PCA主成分分析结果, PCA可以通过数据降维运用ANOVA方差分析不同样本组间差异和距离, 其X轴和Y轴并无实际意义, 百分比表示差异解释度值, 点越接近, 其菌群组成就越相似。数据表明除样本本身外, 电场处理的DY4、DY3、DY2与未经电场处理DY1样本间点的距离远, 表明主成分差异显著(P < 0.05), DY4与DY3样本最相似(P > 0.05), 表明了经电场设备处理后对带鱼微生物菌群组成结构有相当显著的影响。

3 结论

采用Miseq基因组测序技术, 对贮藏至40 d的带鱼微生物群落碱基信息测序, 产生的碱基序列通过OTU聚类、多样性分析、相关性分析等手段分析影响带鱼保鲜效果的微生物群落组成和发育信息, 研究电场强度(0, 2, 2.5, 3 kV/m)对带鱼微生物群落组成的影响。OTU聚类属主要有希瓦氏菌属(Shewanella)、工地杆菌属(Pedobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)等菌属, Chao和Ace丰度指数大小排序为DY1 > DY2 > DY3 > DY4。对照组DY1的OTU多样性高, 有多个独有OTU聚类菌属, 电场处理组DY2、DY3、DY4也有多个独有菌属, 但均无致腐性和致病性。说明3 kV/m电场强度的低压静电场抑菌保鲜效果最好, DY2、DY3次之, DY1效果最差; Alpha稀释性曲线中DY4最先趋平, DY3、DY2次之, DY1直至最后仍未趋平。DY4与DY3、DY2、DY1相关系数分别为0.72、0.67、0.49, 相关程度逐渐缩小。综上说明, 电场能够有效抑制带鱼贮藏过程中腐败菌的繁衍生长, 3 kV/m电场强度的抑菌保鲜效果最好, 2、2.5 kV/m次之, 未施加电场效果最不理想。研究结果为低压静电保鲜技术提供了基础信息。