龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)隶属红藻门(Rhodophyta)、江蓠目(Gracilariales), 是一种生长在潮间带的大型经济海藻。龙须菜不仅可用作琼胶提取原料、鲍的饵料及食材, 而且在去除氮磷、降低海水富营养化、维持海洋生态平衡方面也具有重要的环境效益(Chen et al, 2015)。野生型龙须菜主要分布在山东沿海, 其生长主要集中在春秋两季, 生长的适温范围为12—23℃ (张学成等, 2009)。随着耐高温981品系等的成功培育, 大规模的龙须菜栽培逐渐从原来的北方低温海区扩展到了南方高温海区。但南方夏季海水温度高, 龙须菜无法成功度夏, 并且潮汐以及采收运输过程中藻体还可能会受到渗透胁迫的影响。因此, 研究龙须菜抗逆胁迫对其夏季栽培及运输等具有一定的参考价值。

海藻糖是一种非还原性二糖, 广泛存在于植物、细菌、真菌和无脊椎动物中。海藻糖不仅可用于生物体内碳的存储和运输, 还可作为压力保护剂使生物更好地抵抗不利环境胁迫(Schluepmann et al, 2004; O’Hara et al, 2013; Tang et al, 2016)。高含量海藻糖对于许多沙漠植物如折扇叶(Myrothamnus flabellifolius)、卷柏(Selaginella tamariscina)等的生存是必需的(Goddijn et al, 1999; Paul et al, 2008)。在热激条件下, 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中海藻糖积累量可达到细胞干重的30% (Bell et al, 1998)。拟南芥(Arabidopsis thaliana)中海藻糖含量的增加会提高其对盐胁迫的耐受性(Krasensky et al, 2014)。可见生物体内海藻糖的积累与逆境胁迫存在着密切关系。此外, 海藻糖及其代谢物海藻糖-6-磷酸(Trehalose-6- phosphate, T6P)还参与一些信号调控, 它们可能作为中央代谢调节器, 协调植物中多种代谢通路。

自然界中有5条海藻糖合成途径, 其中OtsA-OtsB途径在生物中分布最广泛, 也是植物中发现的唯一的海藻糖合成途径(Paul et al, 2008)。在植物中, 海藻糖合成由两步反应组成, 首先海藻糖-6-磷酸合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase, TPS)催化尿苷二磷酸-葡萄糖与葡萄糖-6-磷酸合成T6P, 然后T6P在海藻糖磷酸磷酸酶(Trehalose-6-phosphate phosphatase, TPP)催化下脱磷酸形成海藻糖。海藻糖-6-磷酸合成酶在调控碳水化合物代谢、生长发育及胁迫应答响应中起着重要作用。如即使在合适的开花条件下, 缺失TPS1的拟南芥开花也会推迟到很晚(Wahl et al, 2013)。与非转基因水稻(Oryza sativa)相比, 过表达TPS基因的转基因水稻在高盐、干旱和低温条件下能够更好地维持生长和抗光氧化损伤(Li et al, 2011)。在高温下, TPS1基因敲除的酵母菌不生长, 而TPS1过表达的菌株则生长良好(Jiang et al, 2016)。

目前许多生物中TPS基因序列信息已经阐明。尽管高等植物中不会大量积累海藻糖, 但是基因组测序结果显示植物中存在着TPS基因家族。如水稻、小麦(Triticum aestivum)和大豆(Glycine max)中分别有11条、12条和13条TPS基因, 木豆(Cajanus cajan)中则有28条TPS序列(Zang et al, 2011; Singh et al, 2012; Xie et al, 2015)。但是在藻类中关于TPS基因信息及抗逆性的工作较少。在本研究中, 我们分析了从龙须菜基因组中筛选到的4条TPS基因序列, 并在转录、蛋白及酶活性3个水平探究了TPS对高温、高盐及渗透胁迫的响应。该研究丰富了海藻糖在藻类抗逆胁迫中的工作, 为提高龙须菜抗逆性提供了资料。

1 材料与方法 1.1 材料与培养条件

龙须菜耐高温981品系采自福建霞浦县长春镇养殖场(119°59′E, 26°43′N)。首先用毛刷清洗去除藻体表面附着物, 然后挑取生长状态良好的龙须菜, 用镊子截取5—10 cm长的藻体尖部, 置于光照培养箱中进行培养。培养条件为: 温度23 ℃, 光强约40 μmol/(m²·s), 光周期12L : 12D, 培养基使用盐度30的无菌海水。

1.2 材料处理

实验共设置4个组: 对照组(CK: 23 ℃, 盐度30)、高温组(HS: 30 ℃, 盐度30)、高盐组(SS: 23 ℃, 盐度45)和渗透胁迫组(OS: 23 ℃, 盐度30, 5% PEG6000), 其他培养条件与1.1相同, 每组3个重复。分别在培养0、3、6、12 h取约100 mg样品用于实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析; 分别在0、12、24、48 h取约200 mg样品用于蛋白免疫印迹(Western blot)分析或酶活性测定。

1.3 TPS序列的生物信息学分析

结合龙须菜基因组测序和cDNA末端快速扩增(RACE)技术, 我们得到4条龙须菜TPS基因序列, 分别记为TPS1—TPS4。利用ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/)进行TPS蛋白基本理化性质预测。利用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)分析TPS蛋白结构和功能域。使用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对TPS蛋白中跨膜结构进行预测。分别利用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)对TPS蛋白进行信号肽和亚细胞定位分析。用MEGA 7.0软件的邻接法构建TPS系统进化树(饶莉萍等, 2020), bootstrap值设置为1000。

1.4 TPS基因转录分析

参考林丽春等(2019)的方法, 将1.2中的样品进行总RNA提取和cDNA的合成。以actin和eIF为内参基因, 利用Primer Premier 5.0软件设计TPS和内参基因序列的RT-qPCR引物(表 1), 引物序列交由华大基因有限公司合成。所有基因片段均经过T-A克隆和测序验证为正确的序列。在Eppendorf荧光定量PCR仪(Mastercycler ep realplex, Germany)中进行RT-qPCR扩增, 所用试剂和反应程序等参照孙鹏等(2019)的方法进行。采用2^-ΔΔCT法分析目的基因的相对表达水平(Livak et al, 2001)。

1.5 抗体制备与Western blot分析

根据抗体制备原则及TPS氨基酸序列设计多肽序列, 交由杭州华安生物技术有限公司完成抗体制备。经过特异性验证和检测, 只有TPS1蛋白制得了合格抗体, 其多肽序列为NDDPNRIRTTPRSIHC。

根据吕燕等(2019)的方法进行蛋白提取和浓度测定。总蛋白经过SDS-PAGE电泳后, 将胶转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上, 用5%牛血清白蛋白于室温封闭2 h, 然后用封闭液稀释(1:200)的一抗溶液于4 ℃孵育过夜, 洗膜3次, 加入1:8000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG二抗(康为世纪, 货号CW0103)溶液孵育1.5 h, 洗膜, 最后加入Western Bright ECL化学发光液(Advansta)反应后, 在Tanon 5200全自动化学发光图像分析系统中检测、成像, 用Image J软件分析目的蛋白条带的灰度值。

1.6 酶的提取及TPS活性分析

酶提取方法参考Pramanik等(2005)并进行了一些修改。将200 mg龙须菜在液氮中研磨成粉末, 然后加入50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液(含100 mmol/L的NaCl, DTT和PMSF, pH 7.5)提取。最后将提取物以13000×g (4 ℃)离心5 min, 上清液即为酶粗提液。

TPS活性测定方法参考Hottiger等(1987)。该方法检测了在葡萄糖-6-磷酸存在下UDP-葡萄糖中UDP的释放, 以340 nm吸光度的降低来计算UDP的释放量。将每g样品每min形成1 nmol UDP定义为一个酶活性单位(U), 酶活性表示为U/g藻体鲜重(FW)。

1.7 数据分析

采用Excel 2013进行数据处理和作图, 实验数据均以平均值±标准偏差(mean±SD)表示。用SPSS 13.0中的One-way ANOVA和Tukey多重比较进行统计学分析, 以P < 0.05设为差异显著。对于RT-qPCR的数据, 把每个组在0 h时的基因表达量记为1, 将基因表达倍数上调2倍或下调0.5倍设为差异显著(Chang et al, 2014)。

2 结果与分析 2.1 TPS序列和结构特征

龙须菜4条TPS基因编码的蛋白特征如表 2所示, 其在GenBank中的序列号分别为MT919220—MT919223。其中TPS3基因序列最长, 其次是TPS1, 两者分别编码1140和1007个氨基酸, 而TPS2和TPS4开放阅读框较短, 其编码蛋白分子量分别为84.9 ku和100.6 ku。4条序列中, TPS1、TPS2和TPS4为酸性蛋白(pI为5.60—6.14), 而TPS3则偏弱碱性(pI为7.94)。4条TPS蛋白的不稳定指数在43.75—52.98之间, 以≤40为稳定性蛋白的标准, 龙须菜TPS蛋白均为不稳定性蛋白; 平均亲水系数在–0.382和–0.229之间, 均为亲水性蛋白。

对龙须菜TPS蛋白序列进行结构域分析(图 1), 发现4条TPS的N端都有TPS家族保守结构域(Glyco-transf-20), C端都包含TPP家族保守结构域(Trehalose-PPase)。除了以上两个结构域之外, TPS1蛋白的N端还包含一个CBM-2保守结构域(carbohydrate-binding module), 而TPS3蛋白的C端764—882 aa和933—1121 aa各有1个TPP家族保守结构域。跨膜区和信号肽分析发现TPS1—TPS4蛋白均无跨膜区, 也无信号肽序列。亚细胞定位分析结果表明TPS1、TPS2可能位于细胞质或液泡中, TPS3、TPS4则可能位于叶绿体或液泡中。

2.2 龙须菜TPS蛋白序列系统进化分析

在GenBank数据库中选了24条藻类TPS蛋白序列, 将这些TPS与4条龙须菜TPS序列一起构建系统进化树(图 2a)。在进化树中, 28条TPS分列在4个簇中, 各个簇中分别包含1条龙须菜TPS序列。在每一个簇中, 龙须菜TPS与绳状龙须菜(G. chorda)TPS距离最近, 相似性均在99%以上, 与皱波角叉菜(Chondrus crispus)TPS相似性为51%—77%, 3者的4条TPS分别一一对应。其次较为相似的为坛紫菜(Pyropia haitanensis)、温泉红藻(Galdieria sulphuraria)等红藻。

为了进一步分析龙须菜TPS所属亚家族, 我们又将龙须菜中4条TPS与酿酒酵母(S. cerevisiae)TPS序列一起构建了进化树(图 2b)。结果显示龙须菜的4条TPS与ScTPS1聚在一个簇中, ScTPS2、ScTPS3和ScTSL1分布在外围, 说明龙须菜中4条TPS蛋白均与ScTPS1的关系较近。再结合Leyman等(2001)对拟南芥中11条TPS的分析结果, 即AtTPS1—AtTPS4与ScTPS1相似度最大, 属于Class Ⅰ亚家族, 而AtTPS5-AtTPS11与ScTPS2相似度最大, 属于Class Ⅱ亚家族, 我们推测龙须菜中4条TPS序列属于Class Ⅰ亚家族。

2.3 龙须菜TPS基因对3种胁迫条件的响应

龙须菜中4条TPS基因对不同胁迫条件的响应不同(图 3)。高盐胁迫显著促进了TPS1、TPS2和TPS4的转录表达, 而渗透胁迫则多抑制TPS1、TPS2和TPS3的表达。各基因的表达如下:

TPS1基因的表达模式: 在对照组中, TPS1基因的转录水平基本稳定(P > 0.05)。在高温胁迫组中, TPS1表达量呈先上升后下降的趋势, 在6 h和12 h时TPS1基因表达量分别为0 h的1.90倍(P > 0.05)和0.48倍(P < 0.05), 但与对照组中相应时间点之间差异不显著。在高盐胁迫组中, TPS1表达量在3 h和6 h时分别是0 h的2.39倍和2.74倍(P < 0.05), 且与对照组中差异显著。在渗透胁迫组中, TPS1基因表达变化幅度较小, 并且在6 h时低于对照组。

TPS2基因的表达模式: 在对照组中, TPS2基因的表达量随时间的增加而逐渐上升。在高温条件下, TPS2基因表达量在6 h时最高, 但与对照组无显著差异。高盐促进了TPS2基因的表达, 在3、6和12 h时其表达量分别为0 h的7.45、7.19和11.21倍, 但仅在3 h时高于对照组(P < 0.05)。与TPS1类似, 渗透胁迫条件对TPS2基因表达量影响较小, 仅在12 h时低于对照组(P < 0.05)。

TPS3基因的表达模式: 对照组中TPS3基因表达变化稳定。高温处理后TPS3基因表达量在6 h时达到最高, 但与对照组差异不显著。除渗透胁迫12 h时TPS3表达量稍有下降之外, 在其余时间点高盐和渗透胁迫处理对TPS3基因表达量均无显著影响。

TPS4基因的表达模式: 在高温及渗透胁迫条件下, 与前面3条TPS基因表达变化不同, TPS4基因在3 h后表达量均下调。且与对照组各时间点无显著差异。而高盐胁迫时, TPS4基因在3 h和6 h时表达量高于对照组。

2.4 龙须菜TPS1蛋白对3种胁迫条件的响应

龙须菜TPS1蛋白水平变化与TPS1转录变化类似(图 4)。在对照组、高温和渗透胁迫组中, TPS1蛋白表达量在48 h内比较稳定, 与对照组之间也无显著差异。而在高盐胁迫组中, TPS1蛋白表达水平缓慢上升, 在48 h时其表达量达到对照组的2.03倍(P < 0.05)。可见高盐处理可促进龙须菜TPS1转录和蛋白水平的升高。

2.5 龙须菜TPS酶对3种胁迫条件的响应

3种胁迫处理显著影响了龙须菜TPS活性(图 5)。在对照组中, 龙须菜TPS活性比较稳定。在高温组中, TPS活性在24 h达到最高(1.28倍, P < 0.05), 并且高于对照组。在高盐组中, 龙须菜TPS活性在24 h时升高为对照组(24 h)的1.11倍(P < 0.05), 在48 h时其活性降低至对照组(48 h)的66.34% (P < 0.05)。在渗透胁迫组中, TPS活性逐渐下降, 且在12—48 h与对照组差异显著。可见, 高温胁迫可以短时促进TPS活性, 高盐胁迫则先促进、后抑制TPS活性, 而渗透胁迫则会显著抑制TPS活性。

3 讨论

海藻糖具有高度的化学稳定性, 是天然双糖中最稳定的, 素有“生命之糖”之称。海藻糖对生物膜、蛋白质和核酸等生物大分子具有非特异的保护作用(Richards et al, 2002), 其代谢及信号途径在植物生长和抗逆等方面发挥了重要作用。

目前越来越多的全基因组测序工作已完成, 人们在已测序高等植物基因组中发现了庞大的TPS基因家族(Yang et al, 2012)。根据与酵母ScTPS1或ScTPS2的相似性, TPS基因可以被归为Class Ⅰ和Class Ⅱ两个亚家族(Leyman et al, 2001)。近年来, 藻类TPS基因序列也相继被报道。Wang等(2010)克隆了包括海带(Saccharina japonica)、条斑紫菜(P. yezoensis)、坛紫菜等在内的10种大型海藻的TPS基因序列, 并且发现它们在核苷酸和氨基酸组成上具有高度保守性。大型红藻绳状龙须菜和皱波角叉菜基因组中各有4条TPS基因(Collén et al, 2013; Lee et al, 2018), 本课题组在龙须菜基因组中也发现了4条TPS基因(Sun et al, 2018), 且4条TPS基因均属于Class Ⅰ亚家族。TPS氨基酸序列高度保守, 如龙须菜与绳状龙须菜TPS相似性达99%以上, 而基因序列决定功能, 推测TPS基因在进化过程中功能也高度保守。

大量TPS基因家族在高等植物中担负着不同功能, 随着组织和环境的不同而具有不同的表达模式。如毛白杨(Populus tomentosa)中只有10条TPS基因在所有组织及氯化钠、干旱等条件下能够表达; 拟南芥中AtTPS2和AtTPS3不表达, AtTPS4只在根和花中表达, 其余8条基因在根、茎、叶等组织中均能表达(Yang et al, 2012)。相比于高等植物, 藻类中TPS基因家族成员较少, 但这些基因在藻类的抗逆胁迫中也发挥了重要作用。如失水条件下海带TPS基因表达量在3 h最高, 可达到0 h的300倍(Deng et al, 2014); 坛紫菜中3条TPS基因对29 ℃高温胁迫无应答, 而在高度失水胁迫中发挥了应激调节作用(史健志等, 2015)。本文中TPS1—TPS3 3条龙须菜TPS基因在渗透胁迫下多被抑制, 与海带、坛紫菜不同, 推测其原因可能与海带、坛紫菜本身具有较强的脱水性有关。而对于高温胁迫, TPS1-TPS3表达量虽上升但与对照组差异不显著, 即对高温无显著应答, 该结果与史健志等(2015)的研究结果类似, 可能是由于本文设置的30 ℃高温较低的原因。而且, 本文中TPS1蛋白与TPS1基因在应对高温和高盐胁迫时的响应趋势较为类似, 即对高温无明显响应, 而受高盐胁迫的诱导。

在生物体内海藻糖及其代谢物的含量变化与TPS等代谢酶的活性变化密切相关。如受热激处理时金针菇(Flammulina velutipes)中TPS和TPP活性升高, 海藻糖酶活性下降, 海藻糖快速积累(Liu et al, 2016)。在干旱处理14 d的Capparis ovata Desf中TPS和TPP活性上升, 同时海藻糖酶活性降低, 海藻糖含量增加(Ilhan et al, 2015)。与以上结果一致, 本文中TPS活性在高温胁迫24 h时升高, 而海藻糖酶活性降低, 24 h时海藻糖含量开始显著增加(Lv et al, 2019)。但在高盐和渗透胁迫处理下, TPS活性与海藻糖含量无正相关性, 可能是因为海藻糖合成还受TPP的调控。

4 结论

海藻糖不仅是生物体内碳储存物质, 还可作为保护剂来抵抗不利环境胁迫。相比于大多数高等植物和紫菜, 龙须菜中海藻糖含量十分丰富, 因此海藻糖在龙须菜中可能具有重要的作用。龙须菜中4条TPS基因序列高度保守, 推测为Class Ⅰ亚家族。在基因转录、蛋白和酶活性水平上, TPS主要对高盐和高温胁迫响应较大, 而对渗透胁迫不敏感或受其抑制, 该结果有助于更深入地了解海藻糖及其代谢酶在藻类抵御非生物胁迫中的作用, 为提高藻类抗逆性提供了理论资料。