对大多数生物体来说, 氧气是必不可少的, 因此, 生物体中氧的吸收和代谢受严格控制。然而, 环境、病理以及生理条件变化均可导致氧气供应减少(Van Der Meer et al, 2005)。与陆地环境相比, 水环境中溶解氧含量变化剧烈(Bickler et al, 2007)。因此, 与哺乳动物和鸟类相比, 鱼类更能适应溶解氧含量的变化(Xiao, 2015)。低氧胁迫可影响鱼类的行为、生长、摄食、性别和生理状态(Foss et al, 2002; Robertson et al, 2014; Abdel-Tawwab et al, 2015)。而且, 鱼类细胞也可感知和传导低氧胁迫信号, 通过基因表达调控改变生化反应, 从而响应低氧胁迫(Terova et al, 2008)。复杂的生化反应包括血糖浓度降低、糖有氧氧化等代谢反应抑制、乳酸积累、红细胞压积、血红蛋白O₂亲和力以及无氧呼吸增加(Jensen et al, 1993; Virani et al, 2000; Cadiz et al, 2018)。在转录水平, 响应低氧胁迫的基因包括低氧诱导因子(hypoxia-inducible factors, HIF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor-A, VEGF-A)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)和葡萄糖转运蛋白(glucose transporter, GLUT)等基因。HIF是一种主要由低氧诱导细胞产生的重要的转录因子, 介导基因表达的变化, 从而在维持动态氧平衡中发挥着重要作用(Semenza, 1999)。VEGF-A是一种具有血管通透性的蛋白, 可刺激血管生成, 增加O₂供应(Zhong et al, 2009; Shibuya, 2011)。GAPDH是糖酵解通路的关键酶, 催化3-磷酸甘油醛+NAD⁺+P_i反应生成1, 3-二磷酸甘油酸+NADH+H⁺(Chiche et al, 2015)。EPO是低氧胁迫诱导的与红细胞生成有关的蛋白(Xiao, 2015)。GLUT是低氧诱导的促进细胞葡萄糖摄取的蛋白(Zhang et al, 2003)。这些重要基因往往也是氧传感通路(oxygen-sensing pathway)中的关键成员。氧传感通路包括HIF信号转导途经、哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号转导途经、未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)和核因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB)信号转导途经等(Wouters et al, 2008; Majmundar et al, 2010; Xiao, 2015)。上述信号转导途经通过激活转录和抑制翻译等方式促进动物响应和适应低氧胁迫(Wouters et al, 2008; Majmundar et al, 2010)。

大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris, mudskipper)主要分布在中国和日本的潮间带(Chen et al, 2015; 梁亚芳等, 2018)。大弹涂鱼构建的洞穴含水量较低, 水环境中经常出现低氧情况, 可能是少数在低氧环境中自然呼吸的脊椎动物(Aguilar et al, 2000)。由于其特殊的生理特性, 使其成为研究低氧胁迫对鱼类的影响以及鱼类响应低氧胁迫机制较为合适的动物模型。研究鱼类的低氧响应机制, 不仅有助于我们了解低氧信号通路的进化, 而且对耐低氧鱼类物种/品系的选育也具有重要的指导意义。

1 材料与方法 1.1 实验动物

健康大弹涂鱼, 体重30—40g/尾, 购自浙江省宁波市路林市场。暂养期间水温为(24±1)℃, 盐度为10, 不间断充气, 每天投喂饲料一次, 每天换水50%。实验室条件下暂养两周, 并选择全身无病症的鱼进行实验。

1.2 实验方法 1.2.1 大弹涂鱼头肾源单核巨噬细胞(monocytes/ macrophages, MO/MФ)的原代培养

用丁香酚(Eugenol)(国药集团化学试剂有限公司, 上海)麻醉大弹涂鱼, 取血后采集头肾。大弹涂鱼MO/MФ的分离培养参考本实验室已建立的方法(Ding et al, 2019), 采用Ficoll-Paque Premium (GE healthcare, 美国)密度梯度离心方法分离细胞, 获得含有MO/MΦ的白色细胞混悬层。用RPMI 1640培养基洗去未贴壁细胞, 重复2次, 用完全培养基(RPMI 1640、5%胎牛血清、5%大弹涂鱼血清和1%青霉素/链霉素) 24℃继续培养贴壁细胞。经Giemsa′s染色后镜检细胞的形态, 确认超过95%贴壁细胞属于MO/MΦ。

1.2.2 低氧胁迫处理大弹涂鱼MO/MΦ

参考已发表论文, 大弹涂鱼MO/MФ置于细胞培养小室(Billups-Rothenberg, 美国) 24℃培养(Guan et al, 2017)。将大弹涂鱼MO/MФ随机分为2组:常氧处理组(Z组) (21% O₂, 5% CO₂, 4% N₂)和低氧处理组(D组) (1% O₂, 5% CO₂, 94% N₂), 每组3个平行实验, 各组处理8h。处理结束后清洗细胞立即置于液氮中冷冻, −80℃保存备用。

1.2.3 大弹涂鱼MO/MΦ转录组文库构建和测序

用RNAiso试剂(Invitrogen, 上海)方法根据说明书提取大弹涂鱼MO/MΦ的总RNA。采用Illumina Hiseq 4000 (联川生物技术有限公司, 杭州)进行测序。每个样本取出5μg总RNA, 使用Oligo(dT)磁珠(Invitrogen)进行两轮纯化, 对其中带有多聚腺苷酸(PolyA)的mRNA进行特异性捕获。将捕获到的mRNA在高温条件下利用二价阳离子进行片段化。将片段化的RNA基于Illumina RNA连接法(Illumina, 美国)合成cDNA。在Illumina Hiseq 4000平台按照标准程序进行测序, 读长150bp。常氧处理组和低氧处理组各3个生物学重复均同时进行测序。

1.2.4 数据处理与差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)分析

在Illumina Hiseq 4000平台获得原始序列(Raw data), 在RSeQC (2.4)中检测Raw data的质量, 在FastQC (0.10.1)中去除带接头(Adaptor)的reads, 含有N (N表示无法确定碱基信息)的比例大于5%的reads和低质量reads (质量值Q≤10的碱基数占整个reads的20%以上), 得到Clean data。利用HISAT (Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts) (2.0)软件将大弹涂鱼MO/MΦ各个文库的Clean data分别与现有的大弹涂鱼全基因组序列比对。参考基因和基因组注释文件下载自NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ assembly/GCA_000788275.1/)。String Tie (1.3.0)软件用于read比对组装, Ballgown软件用于差异分析。将每个Clean data序列的数目标准化为FPKM (fragments per kilobase of exon model per million mapped reads), 用以代表该基因的表达水平, 在P < 0.05和|log₂(fold change)|≥1条件下(fold change:差异倍数, FC)筛选两个样本之间的DEGs。

1.2.5 基因的功能注释

依据非冗余(Non- redundant, Nr)数据库中的注释信息, 将大弹涂鱼参考基因组转录本序列分别与基因本体论数据库(Gene Ontology, GO) (http://geneontology.org)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG) (www.genome.jp/kegg)数据库进行BlastX比对, 设置E-value为1E-5, 保留每个基因比对到的所有的GO term和KEGG通路, 从而获得每个基因的GO和KEGG注释并使用软件GOseq(1.18.0)和KOBAS软件对差异基因进行GO、KEGG富集。

1.2.6 实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR, qRT-PCR)随机选择10个DEGs,

用Primer Premier 5软件设计引物(表 1), 进行qRT-PCR分析。将各样品进行3次生物学重复的RNA采用第一链cDNA合成试剂盒(Promega, 美国)反转录为cDNA, 以此为模板, 18S rRNA基因为内参, 采用TaKaRa公司的SYBR Green RT-PCR试剂盒, 利用Light Cycler 480 (Roche, 瑞士)进行荧光定量检测。各样品的每个基因重复4次, 按2^–ΔΔCt相对定量法计算相对表达量。反应体系为20.0µL (cDNA模板1.0µL, 上下游引物各1.0µL, SYBR Green染料12.5µL, 无菌去离子水9.5µL)。扩增程序为: 95℃预变性5min, 95℃变性30s, 60℃退火30s, 72℃延伸30s, 变性至延伸共40个循环; 熔解曲线94℃ 30s, 72℃ 60s, 95℃ 30s。所有数据均以标准平均误(standard error of the mean, SEM)表示(Chen et al, 2019)。

2 结果 2.1 转录组测序结果

本研究以三组常氧处理组和三组低氧处理组的大弹涂鱼MO/MΦ总RNA为模板, 构建了6个cDNA文库。利用Illumina Hiseq 4000分别对大弹涂鱼MO/MΦ常氧处理组和低氧处理组进行了转录组测序。原始数据上传至NCBI Short Read Archive (SRA), 登录号分别为SRR9771486—SRR9771491 (Bioproject PRJNA543702)。常氧处理组平均获得46321325个Clean reads, 可比对到参考基因组reads数目平均为41186267个, 占所有reads的88.89%。碱基质量及组成分析显示, 每组GC含量区间为47.00%—48.50%, 各样品Q30的碱基质量值比例均不小于95.40% (表 2); 低氧处理组平均获得52155548个Clean reads, 可比对到参考基因组reads数目平均为47405512个, 占所有reads的90.85%, 碱基质量及组成分析显示, 每组GC含量区间为46.00%—46.50%, 各样品Q30的碱基质量值比例均不小于94.55% (表 2)。

参照大弹涂鱼全基因组转录本信息, 在P < 0.05和|log₂(FC)|≥1条件下, 低氧处理组共获得4487个DEGs (图 1a)。其中上调DEGs有2507个, 下调DEGs有1980个(图 1b)。

2.2 DEGs的GO和KEGG 注释和富集分析

在低氧处理组中, 上调DEGs的GO富集分析结果显示, 共931个基因获得GO功能注释, 包括678个分子功能(molecular function) (34.24%)、308个细胞组分(cellular component) (15.56%)、994个生物过程(biological process) (50.20%)。下调DEGs的GO富集分析结果显示, 共662个基因获得GO功能注释, 包括674个分子功能(molecular function) (37.99%)、221个细胞组分(cellular component) (12.46%)、879个生物过程(biological process) (49.55%)。各选取3个类别中上调或下调DEGs最多的10个GO节点(图 2)。

上调基因中, 排列前三的分子功能类型为翻译(translation)、氧化还原过程(oxidation-reduction process)、DNA复制(DNA replication), 数目分别是43、42、25个; 排列前三的细胞组分类型为细胞核(nucleus)、线粒体(mitochondrion)、细胞溶质(cytosol), 数目分别为144、51、45个; 排列前三的生物过程类型为核糖体的结构成分(structural constituent of ribosome)、RNA结合(RNA binding)、poly(A) RNA结合(poly(A) RNA binding), 数目分别是55、32、15个。下调基因中, 排列前三的分子功能类型为信号转导(signal transduction)、DNA依赖性转录调控(regulation of transcription, DNA-templated)、蛋白质水解(proteolysis), 数目分别是28、28、25个; 排列前三的细胞组分类型为膜的整体成分(integral component of membrane)、膜(membrane)、细胞质(cytoplasm), 数目分别是174、173、88个; 排列前三的生物过程类型为金属离子结合(metal ion binding)、ATP结合(ATP binding)、锌离子结合(zinc ion binding), 数目分别是66、48、42个。

具有注释的上调DEGs有500个, 涉及206条KEGG通路; 具有注释的下调DEGs有357个, 涉及211条KEGG通路相关。选取的上调DEGs前30条显著富集的代谢通路(图 3a)。包括核糖体(ribosome)、DNA复制(DNA replication)、错配修复(mismatch repair)、嘧啶代谢(pyrimidine metabolism)、核酸切除修复(nucleotide excision repair)、细胞周期(cell cycle)、RNA聚合酶(RNA polymerase)、同源重组(Homologous recombination)、氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)等通路。选取的下调DEGs前30条显著富集的代谢通路(图 3b)。下调DEGs涉及包括沙门氏菌感染(salmonella infection)、糖基磷脂酰肌醇-锚定生物合成(glycosylphosphatidylinositol-anchor biosynthesis)、脂肪酸降解(fatty acid degradation)、胰腺癌(Pancreatic cancer)、N-聚糖生物合成(N-Glycan biosynthesis)、胞吞(endocytosis)、糖胺聚糖生物合成-硫酸软骨素/硫酸皮肤素(glycosaminoglycan biosynthesis-chondroitin sulfate/dermatan sulfate)、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia)、ABC转运蛋白(ABC transporters)等通路。

2.3 实时荧光定量PCR结果

从转录组分析结果中随机挑选10个DEGs, 通过实时荧光定量PCR相对定量法检测其在低氧处理组与常氧处理组中的表达差异, 并与转录组分析结果进行比较(图 4)。基因BAX、VEGFA、TBP、CAMKK2、GAPDH、GTF3A、MRPL53、TMEM144、IDE和CHST1210条DEGs在低氧处理后的变化趋势与转录组中基因表达分析结果一致, 证明了转录组分析结果的真实性和可靠性。

3 讨论

低氧是一种重要的环境压力源, 影响水生生物的生存、繁殖、生长和发展, 进而对整个水生生态系统产生深远影响(Shang et al, 2004)。许多鱼类能够在转录水平上运作一套复杂的分子战略来响应低氧胁迫(Gracey et al, 2001; van Der Meer et al, 2005; Zhong et al, 2009)。HIF基因已被公认为低氧信号通路的主要调节因子; HIF基因在维持动态氧平衡和调节低氧条件下氧浓度的变化方面发挥着重要作用(Xiao, 2015)。低氧胁迫120d致使团头鲂(Megalobrama amblycephala, blunt snout bream)的不同组织中HIF-1α/2α基因mRNA表达增加(Li et al, 2015)。低氧胁迫1h后, 河鲈(Perca fluviatilis, Eurasian perch)脑和肝脏中HIF-1α基因的表达增加, 低氧胁迫15d后, 肌肉中HIF-1α基因表达显著增加, 脑和肝脏中HIF-1α基因的表达变化不显著(Rimoldi et al, 2012)。印度鲶鱼(Clarias batrachus, Indian catfish)低氧胁迫1h或6h后, 脑、肝和头肾中HIF-1α和HIF-2α基因表达显著增加, 而在自然条件下的长期低氧胁迫下, 脾脏HIF-1α基因表达显著增加, 肌肉HIF-2α基因表达显著增加(Mohindra et al, 2013)。但研究发现, 其他鱼类中HIF基因的表达方式并不一致。低氧胁迫处理72h后, 花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni, piebald naked carp)多个组织中HIF-1α/2α基因均未检测到显著变化(Qi et al, 2018)。此外, 低氧胁迫1.5h后, 斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus, channel catfish)大部分组织中HIF-1α基因表达显著降低; 而低氧胁迫5h后, HIF-1α基因表达显著增加(Geng et al, 2014)。HIF-1可通过与HIF-1靶基因启动子和增强子区的低氧反应元件(hypoxia response elements, HREs)结合, 激活靶基因的转录表达以响应低氧胁迫, 如VEGF基因(Nikinmaa et al, 2005)。VEGF-A蛋白通过结合和激活VEGFR-1 (VEGF receptor-1)和VEGFR-2, 促进血管生成、血管通透性、细胞迁移和基因表达(Shibuya, 2011)。低氧胁迫7d诱导点带石斑鱼(Epinephelus coioides, orange-spotted grouper) VEGF基因的表达, 而该基因的表达有利于氧输送增加(Yu et al, 2008)。低氧胁迫诱导眼斑星丽鱼(Astronotus ocellatus, cichlid fish) 3h, 肝脏VEGF基因的表达显著增加(Baptista et al, 2016)。虽然GAPDH基因是HIF-1的靶向基因, 但低氧胁迫时GAPDH基因的表达也可激活NF-κB和HIF-1信号转导通路, 进而导致VEGF-A蛋白的分泌增加; 此外, GAPDH蛋白与RNA结合的能力在一定程度上也可以稳定HIF-1α或VEGF-A的mRNA表达(Chiche et al, 2015)。尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus, Nile tilapia)低氧胁迫12h后, 心脏GAPDH基因表达显著增加(Xia et al, 2018)。本研究中, 低氧胁迫大弹涂鱼MO/MΦ 8h, 转录组DEGs分析显示, HIF-1α基因转录本的表达无显著变化, 而VEGF-A和GAPDH基因表达上调。

功能注释可将基因分成功能相关的基因群或归入不同的通路, 可根据基因群的重要性排序, 借助高通量技术快速揭开其中的生物学机制(Xia et al, 2018)。据文献报道, 鱼类在应对短时低氧胁迫时, 氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、糖酵解(glycolysis)和糖原分解(glycogenolysis)通路相关基因表达量显著增加, 显示通过糖类物质分解和氧化磷酸化作为获取能量主要方式, 氧化磷酸化反应增加是低氧的早期反应, 有可能是利于维持ATP的稳定(Everett et al, 2012)。而在长期低氧胁迫中, 脂质分解(lipolysis)则作为能量供应的主要来源(Li et al, 2018)。低氧胁迫长颌姬鰕虎鱼(Gillichthys mirabilis, long-jawed mudsucker) 8h、24h、72h和144h, 心肌的氧化磷酸化通路中的细胞色素氧化酶I基因(cytochrome oxidase subunit I, COI)表达有不同程度的增加; 骨骼肌中, 细胞色素b (cytochrome b, Cyb)和COI基因表达也显著增加, 而在肝脏中这两个基因未显著变化, 但肝脏中糖酵解通路相关基因表达显著上调并且随着胁迫时间的延长而继续增加(Gracey et al, 2001)。低氧胁迫大底鳉(Fundulus grandis, gulf killifish) 4h的肝脏和96h的心脏中氧化磷酸化通路相关基因表达显著增加, 包括复合物I (NADH脱氢酶) (NADH dehydrogenase, ND)和复合物IV(细胞色素C氧化酶) (cytochrome coxidase, COX)的不同亚基基因的表达显著增加(Everett et al, 2012)。低氧胁迫5d后, 日本青鳉(Oryzias latipes, medaka)鳍中糖酵解和氧化磷酸化通路相关基因表达增加(Zhang et al, 2012)。低氧胁迫72h后, 花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)的肌肉中糖酵解/糖异生(glycolysis/gluconeogenesis)通路的相关基因表达增加(Qi et al, 2018)。低氧胁迫2d、4d、7d后, 草鱼(Ctenopharyngodon idella, grass carp)鳃组织中糖酵解途径相关蛋白表达增加(Xu et al, 2019)。低氧胁迫6h后, 杂交斑纹鲈(Morone saxatilis × Morone chrysops, striped bass × white bass)肝脏中脂肪酸代谢和脂蛋白代谢相关基因有明显下调(Beck et al, 2016)。低氧胁迫6h或12h后, 尼罗罗非鱼幼鱼心脏或成鱼肝脏的糖酵解/糖异生通路和脂肪酸代谢通路的相关基因表达均增加(Li et al, 2018; Xia et al, 2018)。低氧胁迫4周后, 尼罗罗非鱼肝脏中糖异生和脂质分解通路相关基因表达上调, 而糖酵解和脂质的合成通路相关基因表达下调(Li et al, 2018)。但也有例外, 如斑马鱼(Danio rerio, zebrafish)低氧胁迫3周后, 鳃中糖酵解通路相关基因表达增加, 氧化磷酸化通路(包括12个ND亚基基因下调, 2个COX亚基基因下调)以及脂质代谢相关基因表达降低(Van Der Meer et al, 2005)。本研究中低氧胁迫大弹涂鱼的MO/MΦ 8h后, 氧化磷酸化通路中有19个基因表达显著上调, 如细胞色素复合物(cytochrome b-c1, Cyb-c1)、COX、ND、ATP合酶(ATP synthase)部分亚基转录本增加。此外, 低氧处理组糖酵解/糖异生通路中GAPDH、磷酸果糖激酶(肌肉)(phosphofructokinase, muscle, PFKM)、果糖二磷酸醛缩酶B (fructose-bisphosphate aldolase B, ALDOB)等6个基因转录本上调。而脂类代谢相关通路(甘油脂代谢、脂肪酸代谢、脂肪酸降解)相关基因表达显著下降。这与上述多数鱼类中低氧胁迫后mRNA或蛋白表达分析一致。

根据上述分析, 本研究大弹涂鱼MO/MΦ短时低氧胁迫后, DEGs、GO以及KEGG富集分析结果与其他鱼类存在差异。低氧胁迫造成基因表达差异可能与物种有关(Qi et al, 2018)。涨潮或冬天, 大弹涂鱼会躲避在洞穴中, 而在洞穴中会经历低氧胁迫(Toba et al, 2014)。大弹涂鱼在洞穴低氧胁迫8h时, 不需进行无氧代谢并且不受到乳酸积累的影响(Toba et al, 2014)。此外, 鱼类在低氧胁迫条件下所产生的应激反应具有组织特异性(Richards, 2009)。而且适当的低氧胁迫可能改变鱼类头肾甚至是分离的MO/MΦ的免疫反应(Kvamme et al, 2013)。

4 结论

综上所述, 本研究采用有参转录组分析方法揭示了在短时低氧胁迫下大弹涂鱼MO/MΦ基因表达及信号通路调控机制, 低氧诱导因子转录本的表达无显著变化, 血管内皮生长因子以及3-磷酸甘油醛脱氢酶基因转录本表达上调。揭示了糖酵解/糖异生和氧化磷酸化可能在MO/MΦ应对短时低氧胁迫中具有重要作用, 为鱼类在低氧条件下的响应机制提供了新的见解。