砗蚝(Hippopus hippopus)隶属砗磲科(Tridacnidae)砗蚝属(Hippopus), 分布于印度洋东部和太平洋西部及我国南海海域, 主要栖息在珊瑚礁砂质底中, 是珊瑚礁生态系统的主要关键框架生物之一(董杨等, 2015)。从全球范围内来看, 砗蚝有两种, 一种是砗蚝, 另一种叫作瓷口砗蚝(H. porcellanus)。在我国分布最多的是砗蚝, 瓷口砗蚝只有零星分布(周勤等, 2014)。砗蚝虽与砗磲(Tridacna)同为砗磲科, 但二者外观上仍有一些差别:首先二者贝壳形态明显不同(杨文等, 2013), 其次砗蚝外套膜不翻出壳缘, 而砗磲外套膜可以翻出壳缘; 另外砗蚝外套膜颜色比较单一, 而砗磲外套膜颜色多种多样, 五彩缤纷。

迄今为止, 砗蚝的人工繁育报道较少。关岛大学海洋实验室描述了砗蚝幼虫及稚贝的早期生活史(Jameson, 1976); 菲律宾席丽曼大学海洋生物研究室报道了砗蚝产卵、幼虫培育及早期生长情况(Alcala et al, 1986)和瓷口砗蚝配子排放及幼虫培育状况(Alcazar et al, 1987); 以上报道均获得了少量壳长为600—800μm的稚贝, 但尚未见培育至幼贝的相关报道。本研究在突破了砗磲人工繁育技术的基础上(张跃环等, 2016), 在我国首次成功进行了砗蚝人工繁育, 为进一步开展南海砗蚝资源修复及珊瑚礁生态系统多样性保护提供了技术保障。

1 材料与方法 1.1 亲本促熟

2016年4月上旬在南海采集活力强、健康无损, 壳长36—40cm, 鲜重为平均5kg/indi.的亲本12个, 共重约60kg。按照15kg/m³的密度放置于中国科学院南海海洋研究所海南热带海洋生物实验站的2个2m³玻璃钢水槽中。采用“微充气+微流水”形式进行人工促熟, 流水量为每缸12m³/d, 经过2周促熟, 砗蚝性腺发育成熟。促熟期间, 海水均经两次砂滤, 海水水温27.5—29.3℃, 盐度32—33, 采用半遮光的方式控制光照强度。

1.2 受精产卵

选取5个性成熟的砗蚝, 注射浓度为0.8mg/mL的五羟色胺催产剂至外套膜中, 之后置于盛有20L新鲜海水的塑料桶中, 几分钟后亲本开始排放精子, 再过几分钟, 开始排放卵子, 单独收集每个个体的精、卵, 用20L塑料桶收集精子, 50L塑料桶收集卵子。一共获得5桶精子和5桶卵子。显微镜镜检发现, 其中2个个体的卵子很圆, 为黑色, 发育整齐, 故选用这2个个体的卵子作为母本; 检查精子发现5个个体精子均较好。采用异体间配对原则, 利用另外3个个体精子与这组卵子受精(平均分为3份), 精卵比例(体积比)为1：60左右。受精后, 每隔3—5min轻轻搅动受精卵一次; 受精1h以后, 将受精卵液倒入玻璃钢池中微充气孵化, 其密度为15indi./mL。

1.3 幼虫培养

受精卵经过30h孵化发育至D形幼虫, 利用对角线70μm筛绢网选优, 共获得600万个D形幼虫。将幼虫放置于3个1m³盛有清新海水的玻璃钢桶中采用微充气法进行培育, 密度控制在2indi./mL以内; 至受精后第6天, 幼虫密度调整为0.5indi./mL。幼虫培育期间, 每天换水一次, 换水量控制在60%, 饵料为金藻, 投喂量在0.5×10⁴—1.0×10⁴cell/mL·d。在此期间, 水温为28.0—29.6℃, 盐度为32—33, pH在8.2—8.3之间, 半遮光控制光照。

幼虫经6d发育至足面盘幼虫后, 将其放置于4×10⁵—5×10⁵cell/mL的虫黄藻溶液中浸泡2h, 幼虫密度控制在30—40indi./mL。采用“微充气+不换水”方式处理, 7—10d幼虫完成变态。在此期间, 水温为28—30℃, 盐度为32—33, pH为8.2—8.3, 半遮光控制光照。

1.4 中间育成

当幼虫完成变态后, 建立了完整的虫黄藻系统。经过1个月的培育, 稚贝壳长达400—500μm, 形成双水管, 运动方式仍为爬行; 经过2个月左右培育, 壳长达1—2mm, 成为幼贝, 与成体砗蚝外观上非常相似, 可站立起来, 利用足丝附着在容器底壁或者附着基上, 完全依赖虫黄藻营养。在此期间, 采用“微充气+微流水”方式饲育, 定期清理培育容器上附着生物及各种藻类等, 半遮光控制光照, 切忌光线过强。

1.5 测定指标

受精率为卵裂受精卵数量与全部卵子数量之比; 孵化率为D形幼虫数量与发生卵裂卵子数量之比; 幼虫存活率为足面盘幼虫数量与D形幼虫数量的比值; 变态率为完成变态稚贝数量与足面盘幼虫数量比值; 稚贝存活率为稚贝数量与刚刚完成变态稚贝数量比值; 幼贝存活率为幼贝数量与刚形成幼贝时数量比值。

卵径、幼虫和稚贝壳长、壳高在显微镜下用目微尺测量; 幼贝壳长、壳高用电子游标卡尺测量(精确值0.01mm); 每个阶段测量90个子代样品。

2 结果 2.1 配子排放

注射五羟色胺催产剂后, 砗蚝在5—7min后开始排放精子, 持续时间为6—8min; 间隔9—10min后开始排放卵子, 持续时间为27—33min(表 1)。为了避免自体受精, 精卵严格分开收集。

2.2 受精孵化

砗蚝卵径为120.08±0.30μm。按照1：60的精卵比例进行异体间配对受精, 受精率(72.4±1.2)%。受精卵经过第一极体、第二极体、2细胞、4细胞、8细胞、多细胞、囊胚期、原肠期、担轮幼虫发育至D形幼虫(表 2, 图 1), 孵化率为93.4%±4.5%(表 3)。在砗蚝受精卵中, 发现了明显的三级卵膜。

2.3 幼虫发育

经过30h胚胎发育, 获得了D形幼虫, 壳长×壳高为(170.13±0.95)×(140.25±0.72)μm, 采用260目筛绢网进行幼虫选育, 放置于1000L玻璃钢桶中, 采用微充气方式进行幼虫培育, 幼虫密度为2indi./mL。经过7d的幼虫培育, 发育至足面盘幼虫, 幼虫足外伸, 匍匐运动, 壳长×壳高为(200.05±1.05)×(170.49± 0.57)μm(表 2, 图 1)。在整个浮游期, 幼虫壳长一直大于壳高, 幼虫累计存活率为10.6%±1.9%(表 3)。

2.4 附着变态

浓缩足面盘幼虫, 利用虫黄藻悬液浸泡2h, 促进足面盘幼虫摄食虫黄藻, 经过反复比较, 发现每次浸泡幼虫摄食比例在20%—30%。多次浸泡可以提高虫黄藻植入幼虫体内的比率, 促进幼虫变态。经过7—14d培育, 足面盘幼虫生活方式由浮游转为底栖, 完成变态, 出现鳃、次生壳, 建立了虫黄藻系统。但是, 变态率较低, 变态率仅为1.4%±0.2%(表 3)。

2.5 稚贝培育

采用“微充气+微流水”的方式进行稚贝培养, 不投喂任何单胞藻, 保持水质清新。受精后第25天, 发育至单水管稚贝阶段, 壳长×壳高=(331.75±18.66)× (270.69±13.52)μm; 受精后第30天, 发育至双水管稚贝阶段, 壳长×壳高=(450.19±32.47)×(361.42±24.16) μm; 受精后第45天, 发育至多触手稚贝阶段, 壳长×壳高=(920.46±75.22)×(901.55±62.58)μm, 即将进入幼贝阶段(表 2, 图 1)。在此期间, 稚贝存活率为14.8%± 2.7%(表 3)。

2.6 幼贝培养

受精后第50天, 当稚贝壳长≥1.20mm, 进入幼贝阶段。与稚贝相比, 贝壳加厚, 变得不透明, 外套膜外伸, 可以站立起来, 进行光合作用为机体提供营养。受精后第120天, 壳长×壳高=(6.32±0.60)×(3.95± 0.45) mm, 出现了贝壳形态转换, 有放射嵴, 贝壳形态扭曲同成体砗蚝比较相似(表 2, 图 1)。在此期间, 幼贝存活率为37.5%±5.4%(表 3)。

3 讨论 3.1 繁殖特点

砗蚝与砗磲同为砗磲科, 二者存在较多相似之处, 但也存在部分差异。相似之处在于: (1) 卵子中包含三级卵膜, 三级卵膜多是腹足类所特有的, 具有提供营养以及保护受精卵功能; (2) 早期发育均经历了胚胎发育、幼虫、虫黄藻系统构建、稚贝、幼贝等阶段(张跃环等, 2016)。不同点在于: (1) 怀卵量不同(同样大小的砗蚝怀卵量仅为砗磲的一半左右); (2) 卵径大小不同(砗蚝卵径为120μm, 而砗磲的卵径为95—100μm), 差异显著; (3) 幼虫浮游趋光性不同(砗蚝幼虫具有较强的趋光性, 经常聚集在水面上, 形成白色面粉状小块, 需要较强的充气或者水流将其驱散开来, 而砗磲幼虫不具有这么强的趋光性); (4) 对基质要求不同(砗蚝幼虫在珊瑚砂底质中容易完成变态, 而砗磲幼虫在珊瑚石底质中具有较好的变态率); (5) 稚幼贝外套膜伸展程度不同(在稚幼贝早期阶段, 二者均有外套膜触手可以伸出壳外缘, 当砗蚝幼贝壳长≥2mm后外套膜无法翻出壳外缘, 而砗磲幼贝外套膜一直可以翻出壳外缘)(Jameson, 1976)。

3.2 附着变态

大多数海洋无脊椎动物均存在浮游幼虫阶段, 能否变态成功被看作是海洋软体动物生命周期中的里程碑, 也是从浮游生活到底栖生活的一个桥梁(Yan et al, 2006)。目前为止, 仅有两篇关于砗蚝幼虫发育的报道, 其变态水平均极其低下, 不足1%。本研究中, 砗蚝幼虫的变态率仅为1.4%, 这可能与砗蚝变态过程中需要构建虫黄藻系统有关。此前, 学者们在开展大砗磲(T. gigas)、无鳞砗磲(T. derasa)、鳞砗磲(T. squamosa)、长砗磲(T. maxima)、诺瓦砗磲(T. nova)、番红砗磲(T. crocea)的人工繁育时, 都发现幼虫变态率均≤1%, 说明砗磲幼虫变态水平偏低, 这是限制砗磲苗种规模化繁育的最大瓶颈。砗蚝、砗磲幼虫变态均需要建立虫黄藻系统, 没有虫黄藻系统幼虫一定无法变态(Fitt et al, 1984)。在这个过程中, 大部分幼虫由于虫黄藻系统构建失败被直接淘汰, 死亡之后招来诸多原生动物清理尸肉, 这些原生动物清理完死亡个体后, 又会侵蚀健康的处于变态中或者刚刚完成变态的个体, 从而造成变态水平极其低下。因此, 在苗种繁育中, 提高砗蚝幼虫变态率至关重要。

3.3 中间育成

中间育成包括稚贝培养和幼贝培养, 是生产贝类大规格苗种的必要手段(张国范等, 2010)。在砗蚝中间育成的过程中, 发现两种敌害是其能否成功的关键所在。

一是丝状藻。在流水培养过程中, 经常会出现大量丝状藻粘在砗蚝稚贝或者幼贝壳面上, 之后将整个个体包围, 导致无法开壳进行光合作用, 因为营养匮乏或者窒息死亡(Fatherree, 2006)。目前发现两种主要的丝状藻, 一种为绿色, 毒害作用不强, 稚、幼贝死亡率不高, 一般在30%以下; 还有一种为黑色, 毒害作用很强, 一旦暴发, 稚幼贝死亡率在90%以上, 甚至全军覆没。为了有效防止丝状藻对稚、幼贝的危害, 在其繁育过程中一定要以防为主, 从源头上消灭丝状藻的孢子来源, 这样就可以有效防止丝状藻滋生。

二是一种小型锥形螺(Turbonilla sp.)。这种锥形螺会从稚、幼贝足丝孔部位吮吸软体部组织, 从而引起个体死亡(Fatherree, 2006)。锥形螺是小塔螺科(Pyramidellidae)下的一个属, 这类螺通常个体较小, 最大在10mm左右, 具吻, 多营体外寄生生活, 通过口针刺进寄主软体组织中, 然后吸食寄主体液及软体组织, 大多寄生在多毛类、棘皮类、贝类或者甲壳类等无脊椎动物体外。由于锥形螺与砗蚝繁殖期比较一致, 在自然界中, 砗蚝稚、幼贝经常与锥形螺生活在一起, 故对砗蚝存活造成一定程度的危害(陈志云等, 2011)。在中间育成过程中, 如果出现这种小规格锥形螺, 一定要及时清理, 否则会造成稚幼贝不断死亡, 直到全部死光。为了防止这种小规格钉螺造成伤害, 需要勤观察, 发现后及时清理即可。

4 结论

本文通过亲贝促熟、催产孵化、幼虫培育、稚贝培养及中间育成等技术环节, 在我国首次培育出砗蚝幼贝, 同时比较了砗蚝与砗磲的表型差异, 填补了国内相关研究空白, 为南海砗蚝资源恢复及珊瑚礁生态系统修复奠定了良好的基础。

致谢 感谢中国科学院海南热带海洋生物实验站对本文的大力帮助。