多鳞四指马鲅(Eleutheronema rhadinum)与四指马鲅(E.tridactylum)均隶属于辐鳍鱼纲(Actinopterygii)、鲈形目(Perciformes)、马鲅科(Polynemoidea)、四指马鲅属(Eleutheronema)(庄平等，2006)。由于多鳞四指马鲅与四指马鲅在形态上相似度高，曾一度将多鳞四指马鲅与四指马鲅混淆，直到Motomura等(2002)对四指马鲅属鱼类进行重新划分，才将多鳞四指马鲅从四指马鲅种中划分出来，并确定四指马鲅属包括多鳞四指马鲅、四指马鲅、三趾四指马鲅(Eleutheronema tridactylum)三个种。目前，在我国常见为多鳞四指马鲅与四指马鲅，主要分布在我国东海及南海海域。多鳞四指马鲅及四指马鲅均为大型经济鱼类，具有生长速度快、盐度适应范围广、经济价值高等特点，是海水鱼类中的名贵种，具有较好养殖开发前景，已被FAO作为重点推广的养殖鱼类(Rainboth，1996)。但由于对四指马鲅属鱼类研究起步较晚，仅在资源调查(蒋日进等，2008;陈渊戈等，2011;龚小玲等，2011)、遗传结构(林少珍等，2012;Horne et al，2013;Sun et al，2013;Wang et al，2014)、生物学(黄桂云等，2012;常有民等，2013)及人工繁育(毛连环，2009)等方面有相关报道，特别是利用遗传结构开展资源鉴定方面的研究较为罕见，目前仅靠个别形态特征进行多鳞四指马鲅和四指马鲅鱼类的物种鉴定，给两物种资源评估与人工养殖开发带来一定困难。

形态学具有易操作、受样品状态影响小、结果直观等优势，已被许多研究者应用于鱼类群体及物种间差异分析的研究中。多变量形态度量学方法是基于框架位点而引入多元统计的一种分析方法，是对鱼类外部形态的连续性特征差异的分析，可更加全面反应种内及种间差异(Bookstein et al，1985)。简化基因组测序技术是目前最高效的群体分析的手段之一，近年发展起来的方法主要有GBS、RAD-seq、SLAF-seq等。该技术通过选取合适的限制性内切酶结合高通量群体测序构建SNP分子标记，性价比高、稳定性好，可广泛用于群体进化分析、高密度遗传图谱构建、QTL定位以及辅助基因组组装连接染色体等领域(陈士强等，2013)。基于SLAF-seq技术的SNP多态分子标记以及InDEL分子标记的开发，通过测序扫描整个基因组中存在的单核苷酸多态性(SNP)、结构变异(SV)等遗传变异，开展遗传图谱研究，完善鱼类育种和选择技术。

针对多鳞四指马鲅与四指马鲅种质鉴定研究较为缺乏的现状，本研究首次应用框架形态学方法对多鳞四指马鲅及四指马鲅两物种形态差异进行比较，并利用简化基因组测序技术(SLAF-Seq)，对我国两种易混淆的四指马鲅鱼类进行多态性标记分析，获得大量的变异信息(SNPs、InDels)，为进一步开展多鳞四指马鲅及四指马鲅物种资源评估与管理、人工选育和功能基因开发等提供基础参考。

本实验于2013年11—12月，在湛江海域采集多鳞四指马鲅与四指马鲅样本。所有样本采用Motomura等(2002)形态鉴定方法进行初步鉴定后，用于形态数据测量，并取背部肌肉放置于95%的酒精中，低温保存。观察样本数量和规格见表 1。

测量数据分为传统形态学测量数据和框架形态数据两部分。传统形态数据包括全长(TL)、头长(HL)、肛前体长(LBA)、叉长(FL)、体高(BH)、眼后头长(PL);并参照杨阳等(2013)的框架测量方法建立多鳞四指马鮁框架定标点，形态学测量参数用钢尺和游标卡尺测量，精确至0.1mm，框架数据测量图见图 1。

图 1 多鳞四指马鲅与四指马鲅的框架测量图(杨阳等，2013)Fig. 1 The framework measurement diagram ofE. rhadinum and E. tridactylum 1—11为定位点; 1: 吻前端; 2: 鳃盖腹部末端; 3: 腹鳍起点; 4:第一背鳍起点; 5: 第一背鳍末端; 6: 第二背鳍起点; 7: 第二背鳍末端; 8: 臀鳍起点; 9: 臀鳍末端; 10: 尾鳍上叶起点; 11: 尾鳍下叶起点

图选项

为消除样品个体规格差异对形态分析的影响，采用Reist(1985)的方法对原始测量数据进行校正，校正公式为: e=exp[lnY-b(lnX-lnX_L)]。其中e为校正值，Y为测量值，b为lnY与lnX的斜率，X为样本体长，X_L为所有样本的平均体长。校正后可量性状及框架性状的标准数据运用SPSS(version 19.0)统计软件进行分析。

采用利用多变量方差分析方法对多鳞四指马鲅群体及四指马鲅群体的26个形态特征值进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，提取主成分，并对主成分中相关变量贡献率进行分析。

应用逐步判别法对多鳞四指马鲅及四指马鲅群体进行判别分析(discriminant analysis)。

判别准确率的计算公式为:

式中:O=该群体判别正确的尾数，M=该群体实际尾数，A_i=第i个群体中判别正确的尾数，B_i=第i个群体中的实际尾数，k=群体数。将校正数据在SPSS 19.0软件运用逐步判别法进行判别分析，构建2个群体的判别函数。

采用蛋白酶K和苯酚/氯仿法提取基因组DNA(马洪雨等，2006)，以半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)(GC含量40.81%)作为参考基因组设计酶切方案。分别取多鳞四指马鲅和四指马鲅基因组DNA各500ng，加0.6 U MseI(NEB，Hitchin，Herts，UK)、T4 DNA连接酶(NEB)、ATP(NEB)和Mse I接头(NEB)在37℃下反应15 h，65℃退火1 h，然后加限制性内切酶Hae III和Bfa I在37℃下反应3 h。反应结束后用Quick Spin column(Qiagen)纯化酶切产物。

以回收的酶切产物为模板进行PCR反应，反应体系25μL，包括模板DNA 100ng、10×buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、5U的TaqDNA合成酶(NEB)0.3μL、10 μmol/L MseI引物2 μL、ddH₂O加至25 μL。PCR产物经E.Z.N.A.Cycle Pure Kit(Omega)纯化后，加入Mse I、T4DNA连接酶、ATP及Solexa接头，37℃下反应5 h。利用Quick Spin Column(Qiagen)纯化产物，2%琼脂糖胶电泳，并以其为模板，在含PhusionMaster Mix(NEB)和Solexa引物混合物中进行PCR扩增，扩增产物经纯化后用Illumina GAIIx(Illumina，San Diego，CA，USA)测序。

从外部形态特征比较，多鳞四指马鲅无梨骨齿板，胸鳍基部有黑色斑块，侧线鳞83—97，侧线上鳞12—14，侧线下鳞15—17;四指马鲅有梨骨齿板，胸鳍基部有黄色斑块，侧线鳞71—79，侧线上鳞9—12，侧线下鳞13—15。两群体可数性状特征比较如表 2所示。

表 2 多鳞四指马鲅与四指马鲅群体形态特征比较 Tab.2 The morphological comparison betweenE. rhadinum and E. tridactylum populations

群体	鳞式	胸鳍	背鳍	腹鳍	臀鳍	尾鳍
多鳞四指 马鲅	83—97	17—18	Ⅷ—Ⅰ，13—14	I—5	Ⅲ—14	18—22
四指马鲅	71—79	17—19	Ⅷ—Ⅰ，13—14	I—5	Ⅲ—15	19—23

表选项

对多鳞四指马鲅群体与四指马鲅群体的形态测量数据进行主成分分析，共提取了7个主成分，累积贡献率为96.112%，其中前三个主成分贡献率分别为28.759%、21.467%、15.469%，累计贡献率65.695%。在第一主成分中D1-2、D1-4、D5-8、D6-8、D6-9、D7-9、D7-10、D7-11的负荷绝对值较大，主要反应的是鱼体头部、后半部分体侧及尾柄部特征;第二主成分中头长、叉长、肛前体长、眼后头长、D9-11的负荷绝度值较大，主要反应的是鱼体头尾轴特征;第三主成分中D3-4 、D3-5、D3-8、D4-8的负荷绝对值较大，反应的是鱼体前半部体侧的形态特征(详见表 3)。

图 2为多鳞四指马鲅与四指马鲅群体形态分析前两个主成分的散点图，从散点图分析，利用前两个主成分可将多鳞四指马鲅群体与四指马鲅群体进行划分，并且2个群体在主成分1坐标轴上的差异比主成分2坐标轴的差异显著。

图 2 2个群体形态特征前两个主成分分布图 Fig. 2 The distribution of first 2principal components in morphological indices of the two populations

图选项

本研究利用逐步判别方法，对2个群体野形态比例性状进行判别分析。根据逐步判别法，筛选变量，从特征性状中帅选出PL、D9-11、D5-8、D6-8四个特征值进行判别分析，综合判定准确率即可达到100%，该判别函数对于两物种的形态鉴定提供了重要参考。利用个形态特征值构建了多鳞四指马鲅群体与四指马鲅群体的判别函数，其判别公式如下:

其中，X₁—X₄分别代表PL、D9-11、D5-8、D6-8。将判别函数带入多鳞四指马鲅与四指马鲅群体进行检验，综合判定准确率为100%(表 4)。

图 3 SLAF标签分型统计结果 Fig. 3 The statistical results of SLAF tagtype

图选项

表 5所示利用简化基因组测序技术，开发出多鳞四指马鲅与四指马鲅SNP 69207个，其中转换类型中: C/T 22458个(32.45%)，A/G类型22173个(32.04%);颠换类型中A/T 7900(11.42%);A/C 6171(8.92%);T/G 6040(8.73%);C/G 4465(6.45%)。

多鳞四指马鲅样本和四指马鲅样本之间总共开发出12884个InDel，包含转化类型773个(6.00%)，颠换类型8031个(62.33%)，样品中杂合类型4080个(31.67%)。

早在19世纪，研究学者Bleeker(1862)开始对多鳞四指马鲅进行分类鉴定，将其鳞片大小、有无犁骨齿板等定义为区分四指马鲅属鱼类的主要形态特征。Motomura等(2002)利用测定鱼体可量性状、可数性状以及外部典型特征区分四指马鲅属多鳞四指马鲅、四指马鲅、三趾四指马鲅三个物种。但传统的鱼类形态学研究参数主要遵循Hubbs等(1947)提出的在鱼体头尾轴及背腹轴水平及垂直方向的测定方法，而框架测量法利用鱼体的解剖学同源坐标点，可有效反映鱼体纵向、斜向和中间部分的许多信息(Erguden et al，2005)。目前国内外已广泛开展了利用多变量形态学方法对鱼类形态差异的比较研究，如狼鲈(Dicentrar­chus labrax)(Erguden et al，2005)、澳洲鲐(Scomberaustralasicus)(Tzeng，2004)、鲻鱼(Mugil cephalus)(刘建勇等，2009)等，均得到较好的判定效果。

从主成分分析结果来看，多鳞四指马鲅与四指马鲅形态差异主要集中体现在鱼体头背部、尾柄部、头尾轴及背腹轴的特征上。两群体形态特征差异与栖息的水域环境及游泳运动相关，以适应其生活环境及洄游、摄食等生活习性。其中背腹轴及头尾轴差异影响了鱼体的体型特征，头尾轴长、背腹轴短的鱼类体形为纺锤型，在水中游动阻力小，承受水压能力强，更适宜在水流湍急的环境中游动;尾柄则起到平衡及前进助推的作用;而鱼体头背部形状对其游泳速度可产生影响。目前已有研究资料报道，多鳞四指马鲅与四指马鲅主要栖息在河口近岸(Motomura et al，2002)，多鳞四指马鲅具有生殖洄游习性，幼鱼在河口索饵育肥(陈渊戈等，2011;龚小玲等，2011)。多鳞四指马鲅与四指马鲅具有纺锤型体形，对两种群适宜沿岸近海水流湍急的栖息环境及洄游习性具有重要意义。目前关于多鳞四指马鲅及四指马鲅背景资源缺乏，后续可结合两个物种资源调查数据对两种群的栖息地、生活习性、摄食方式等开展进一步的研究。

本研究利用4个形态特征值建立了多鳞四指马鲅与四指马鲅判别函数，判别函数经回代检验综合判别准确率达到100%，相比传统形态学鉴定，该方法更加全面反映多鳞四指马鲅与四指马鲅的形态差异。赵峰等(2011)利用4个形态参数将三种鲳鱼100%予以区分;王新安等(2008)利用多元分析方法建立七带石斑鱼不同地理群体的判别函数，综合判定准确率同样达到了100%。本研究结果进一步证实利用传统形态学及框架数据进行多变量分析是一种理想的形态学鉴定方法。

由于生物形态是物种多个性状的集合，是遗传因子和环境因素共同作用的结果。因此分析及鉴定多鳞四指马鲅与四指马鲅种群差异，应在形态学判定的基础上，结合两群体遗传结构差异，进一步进行比较研究。目前开发SNP标记的方法很多，但大多技术繁琐、成本高。SLAF-seq技术是基于生物信息学、高通量测序仪等的高度自动化技术，获得的海量序列信息可满足任何密度的全基因组分布，以实现候选功能区域的精细定位，数字化信号和高覆盖保证了获得标签的准确性，高通量分子标记开发成本低于常规分子标记，可以一次性获得大量的特异DNA序列，为开发大量的特异分子标记提供了序列基础。据北京百迈客公司统计，SLAF-seq技术开发分子标记的平均成本不到AFLP技术的1/8，而其效率却高近27倍，与转录组技术相比在也可以较低成本获得大量标记。可见，利用SLAF-seq技术开发四指马鲅属鱼类特异分子标记具有很高的重复性、特异性及实用性。目前，国内外尚无多鳞四指马鲅与四指马鲅遗传差异相关报道，本研究利用SLAF-seq技术首次对四指马鲅属两个重要经济物种进行遗传结构差异分析，挖掘出两近似种遗传结构上存在的大量差异位点，大大降低了试验成本，由于方法原理差异，本研究得出四指马鲅属两种鱼类的SNP位点转换的概率远大于颠换概率，此结果与利用转录组技术开发鲤鱼(Cyprinus carpio)(Li et al，2015)SNP结果不同。本研究为后续开发多鳞四指马鲅与四指马鲅共显性分子标记，在遗传结构上进行物种鉴定提供有力的基础研究参考，也对开发四指马鲅属鱼类相关功能基因、群体遗传学、基因组作图、物种间比较基因组学等研究具有重要意义。