蓝藻(Cyanobacteria)又称为蓝细菌或蓝绿藻，是一类进化历史悠久、革兰氏染色阴性、无鞭毛、含叶绿素a(但不形成叶绿体)、能进行产氧性光合作用的大型原核微生物。蓝藻的分布广泛，从水生到陆生生态系统，从热带到南北极均有分布。蓝藻是海洋生态系统和海洋初级生产力的重要组成部分(孙晟等，2003; Paul，2008)。蓝藻结构简单，细胞内没有真正的细胞核结构和色素体，只有核质和色素两大部分。蓝藻的繁殖方式有两类，一类为营养繁殖，包括细胞直接分裂(即裂殖)、群体破裂和丝状体产生藻殖段等几种方法; 另一类为可产生内生孢子或外生孢子等，以进行无性生殖。蓝藻主要有微囊藻、螺旋藻、项圈藻、颤藻等，其中微囊藻的危害最大(Asselman et al，2014)。根据长期的观测，发现在大多数情况下，在特定湖区内，这种突然“暴发”的水华是在适宜的气象与水文条件下，该湖区内亦已存在的、悬浮于水体中的蓝藻群体再加上其它湖区的水华蓝藻，随着风和湖流的驱动，漂移到该湖区聚集上浮至水面，并为人们肉眼所见的过程(孔繁翔等，2009; O’Neil et al，2012)。蓝藻作为河湖水华中的常见优势种群，引起的蓝藻事件是目前社会普遍关注的问题。蓝藻水华的暴发是水体富营养化特征之一。蓝藻通过产生毒素、死亡个体分解使水体缺氧和破坏正常的食物链威胁到饮用水安全、公众健康和景观，会造成严重的经济损失和社会问题(马健荣等，2013)。因此人们开始关注蓝藻，并取得一定的进展。眼虫门是一群鞭毛生物，兼有叶绿素和眼点，兼有动物和植物的特性，在植物学、藻类学中称为“裸藻”，而在原生动物学中称为“眼虫”，因此眼虫门也称作裸藻门。眼虫门主要有两个纲: 裸藻纲和动质体纲。在本次研究中的主要对象是裸藻纲，这类生物在水华和赤潮中也起一定的作用。

藻-菌关系一直是研究的热点问题之一，但目前主要集中在海洋、湖泊赤潮藻方面，陆源排污口中的蓝藻和裸藻纲生物未见报道。本文选取宁波沿海10个主要的陆源排污口，分别对排污口处和距排污口50m以外的20个站位的水样进行分析，对每个站点进行总体和单独分析，研究蓝藻和裸藻纲生物种类和分布特点。

选取宁波沿海10个陆源排污口和距离排污口50m以外的10个站位作为采样位点(见图 1)。分别于2011年3月、5月、8月、10月进行采集，每次采集4L水样。

图 1 采样站位区域分布图 Fig. 1 Map of sampling site S1: 象山爵溪东塘排污口; S2: 象山水桶岱垃圾场排污口，S3: 象山石浦水产加工园区排污口，S4: 象山西周工业园区排污口，S5: 象山墙头综合排污口，S6: 北仑三山排污口，S7: 宁海西店崔家综合排污口，S8: 奉化下陈排污口，S9: 宁海颜公河入海排污口，S10: 余姚黄家埠排污口; 其中S5和S9为重点排污口，其余为一般排污口

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取排污口的海水，以0.22μm的微孔滤膜富集微生物，利用试剂盒提取基因组 DNA(美国Omega生物技术公司)。

根据细菌16S rRNA的保守序列，利用Primer Premier 5.0设计扩增引物: 16S F(5’-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3’)和16S R(5’-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG-3’)。

20μL扩增反应体系: 10×buffer 2μL，MgCl₂ 2μL，dNTP 2μL，上游引物和下游引物各25μL，0.2μL Taq DNA聚合酶和1μL DNA模版。PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测(Wang et al，2014a，b)。

PCR扩增条件: 94℃预变性4 min，94℃变性30 s，退火温度从65℃到55℃，退火30 s，20个循环; 72℃延伸30 s，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30s，35个循环; 最终72℃延伸10 min(刘兵等，2009)。

将纯化后的PCR产物进行454焦磷酸测序(Margulies et al，2005; 王中华等，2014)，结果用罗氏软件2.5.3进行信号处理分析。根据蓝藻细菌在文库中出现的频次数量，进一步用R For Window 2.15.2、SPSS等进行统计分析。

通过对454高通量测序共检出眼虫门的裸藻纲(Euglenoidea)、蓝藻门的集球藻目(Synechococco­phycideae)、颤藻目(Oscillatoriophycideae)、念珠藻目(Nostocophycideae)、粘杆菌目(Gloeobacterophycideae)，具体数量见表 1。

通过对454高通量测序平台结果进行比对分析发现: 在3月份，S4象山西周工业园区排污口、S7宁海西店崔家综合排污口蓝藻和裸藻纲生物数量最多，S7宁海西店崔家综合排污口次之。在5月份，S4象山西周工业园区排污口的检出次数最高，S6北仑三山排污口、S7宁海西店崔家综合排污口和S8奉化下陈排污口次之。在8月份，S7宁海西店崔家综合排污口的检出次数最高，S9宁海颜公河入海排污口次之。在10月份，S6北仑三山排污口检出次数最高，S7宁海西店崔家综合排污口和S9宁海颜公河入海排污口次之。

3月份的蓝藻和裸藻纲生物检出次数最高，8月份和10月份检出次数较低。其原因是8月份东海海洋表面平均温度达到年最高值约为30—35℃，高温使部分工厂停产休息，因此污水排放量减小(陈丽萍等，2013)，3月份的时候排污量较多，而且气温较低适于这两类生物的生长，因此检出次数与季节温度、空气湿度有关(图 2)。

图 2 不同月份蓝藻和裸藻纲生物在排污口的分布情况 Fig. 2 The distribution of Cyanobacteria and Euglenoidea in different sewage outlets and months

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3月份，距S7宁海西店崔家综合排污口50m处蓝藻和裸藻纲生物数量最多，距S4象山西周工业园区排污口50m处含量次之; 5月份，距S7宁海西店崔家综合排污口50m处含量最高，距S4象山西周工业园区排污口50m处含量次之; 8月份，距S7宁海西店崔家综合排污口50m处含量最高，距S6北仑三山排污口50m处含量次之; 10月份，距S6北仑三山排污口50m处含量最高，距S7宁海西店崔家综合排污口50m处含量次之(图 3)。

图 3 不同月份各排污口的蓝藻和裸藻纲生物数量与50m的站位点的比较 Fig. 3 Comparison in Cyanobacteria and Euglenoidea quantity between each sewage outlet and a site 50m away in different months M3，M5，M8，M10分别表示3，5，8，10月份排污口站位; M3-50，M5-50，M8-50，M10-50分别表示3，5，8，10月份距排污口50m以外的站位

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蓝藻和裸藻纲生物大量出现时，附近水体一般呈蓝色或绿色，水面被大量藻体覆盖。蓝藻细胞尤其是微囊藻将毒素释放到水里，由于本身的机制使得其在夏天的富营养水体中容易大量暴发生长，造成严重的水体生态灾难(Bresciani et al，2014)。微囊藻毒素对人体肝功能有很大的伤害，生活在湖边、池塘边和海边的人容易通过饮用水和食用藻类中毒(王伟琴等，2010; Urrutia-Cordero et al，2013)。宁海西店镇是中国著名的“牡蛎之乡”，牡蛎营养丰富，具有各种人体必需氨基酸对降低血糖也有一定的作用(滕瑜等，2005)，冬季是西店牡蛎最盛产也是蛎肉最肥美的季节。而蛎肉品质与海水的质量有着紧密联系，某些蓝细菌(如集球藻目)会通过内吞的方式进入牡蛎组织内部达到寄生目的，进而在牡蛎组织内部累积，从而污染了牡蛎的肉质(Avila-Poveda et al，2014)，因此3月份应重点加强对S7号排污口的监控，以免造成牡蛎污染和经济损失。

在3月份，S4号象山西周工业园区排污口裸藻纲生物检出频次最高(排污口1906次，距排污口50m处2223次)，占3月份所有检出生物总量的20.83%，蓝藻检出频次则较少(排污口124次，距排污口50m处106次); S2号象山水桶岱垃圾场排污口中两类生物排出量最少(排污口0次，距排污口50m处51次)。说明S2号3月份排污口排出的污染物中没有这两类微生物需要的营养。而其它排污口均是裸藻纲生物的检出频次最高(图 4)。在5月份，各排污口蓝藻检出频次均较少，S4号象山西周工业园区排污口裸藻纲生物检出频次最高(排污口629次，距排污口50m处557次)，S6号北仑三山排污口裸藻纲生物检出频次也较高(排污口处231次，距排污口50m处343次)，S1号象山爵溪东塘排污口裸藻纲生物检出频次最低(排污口处3次，距排污口50m处3次)。在8月份，S7号宁海西店崔家综合排污口裸藻纲生物检出频次最高(排污口处1077次，距排污口50m处2040次)，其它排污口裸藻纲生物检出频次都较低。各排污口集球藻目检出频次均偏低，其中S8号奉化下陈排污口检出频次最高(排污口处236次，距排污口50m处4次)，S6号北仑三山排污口集球藻目检出频次次之(排污口处180次，距排污口50m处195次)。而S2、S3、S5号则没有集球藻目。在10月份，S6号北仑三山排污口集球藻目检出次数最高(排污口处344次，距排污口50m处249次)，而裸藻纲检出频次较低(排污口处129次，距排污口50m处404次)，S9宁海颜公河入海排污口叶绿体目检出频次最高(排污口212次，距排污口50m处193次)，集球藻目检出次数则较低。

图 4 不同月份和不同站位排污口的蓝藻和裸藻纲生物检出次数 Fig. 4 The numbers of Cyanobacteria and Euglenoidea in the sewage outlets in different months M3，M5，M8，M10分别表示3，5，8，10月份排污口站位; M3-50，M5-50，M8-50，M10-50分别表示3，5，8，10月份距排污口50m以外的站位

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S7宁海西店崔家综合排污口和距排污口50m处裸藻纲生物的检出次数总数最高，说明S7号处的海水质量更适合裸藻纲生物的生长。宁海西店崔家综合排污口的主要污染物没有氨氮化合物，而其它排污口处氨氮浓度较高。裸藻纲生物的生长并不只是受氨氮含量的影响，氮磷比对裸藻纲生物的生长影响较大，在低磷情况下(0.02mg/L)，氮磷比为4︰1—32︰1范围内，某些生物(如铜绿微囊藻和斜生栅藻)的生长均受到营养盐的限制，当磷浓度达到0.20mg/L时，这两种藻类分别在在N/P比为32︰1和64︰1时生长速率达到最大值，而在磷浓度升高到2mg/L时，氮磷比对生长速率已经没有影响(Sabour et al，2009; 许海等，2011)。可以推测S7号排出的污水中氮磷比适合裸藻纲生物的生长，因此应该加强对S7号氮磷含量的监控，以避免出现水华现象(图 4)。

S9号宁海颜公河入海排污口和S5号象山墙头综合排污口为宁波市两个重点沿海排污口。两类生物检出频次在时间和数量上有明显的差异。S9号宁海颜公河入海排污口中的裸藻纲检出频次最高为3月份，高达1099次，最低为5月份的35次，蓝藻的检出次数在3、5、8、10月份检出频次均很少，最高为8月份16次。S5号象山墙头综合排污口裸藻纲检出频次最高为5月份，高达23次，其它月份排污口裸藻纲的检出频次都在15次以下，而蓝藻在四个月份检出频次一共只有3次(图 5)。S9号宁海颜公河入海排污口和S5号象山墙头综合排污口排出的主要是裸藻纲。

图 5 重点排污口蓝藻和裸藻纲生物各月份检出频次 Fig. 5 The number of Cyanobacteria and Euglenoidea in major sewage outlets in different months

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S9号宁海颜公河入海排污口的主要污染物为磷和氨氮，S5号象山墙头综合排污口的主要污染为粪大肠菌群、苯胺、生化需氧量。这两个重点排污口两类生物检出频次均相对较少，说明这两个排污口污染物中氮磷比含量不适合它们生长。但是宁海颜公河排污口和象山墙头综合排污口分别在3月和5月裸藻纲的检出量达到最大值，宁海颜公河排污口3月份裸藻纲检出频次要高于象山墙头综合排污口在5月份的检出频次，这可能与宁波3月份和5月份气温有关系，3月份平均气温比5月份平均气温低10℃左右，推测裸藻纲生物更适宜较低温度生长; 蓝藻检出量分别在8月和5月达到最大值。宁波8月份日均最低温度为25℃，日均最高温度为32℃; 5月份日均最低温度为17℃，日均最高温度为25℃，铜绿微囊藻在15℃的生长速率和生长量低于在20℃、25℃下的生长速率，20℃条件下铜绿微囊藻在前期的生长速率低于在25℃下的生长速率，而在17d时两种条件下的生长量开始相等。铜绿微囊藻更容易在5月份生长，所以应根据温度变化做好对蓝藻生长的防治，以免其毒素在水产品中(如藻类、螺类、贝类和各种鱼类)积累，对人类健康造成危害(陈建中等，2010)。

利用454高通量测序技术，确定了宁波沿海2个重点排污口、8个一般排污口的20个站位的海水中，含有叶绿体的裸藻纲生物检出量最高，蓝藻门的集球藻目次之。由于季节性的影响，排污口的污染物和温度也会发生相应的变化，进而影响蓝藻的生长。裸藻纲生物的检出量也受各排污口中氮磷比含量影响较大，不同的生物在不同的氮磷比的条件下生长速率也会不同，S7号排污口中污染源更适合裸藻纲生物的生长。S9号和S5号排污口作为宁波市两个重点陆源排污口，两种生物检出量均相对较低，分别在3月份和5月份裸藻纲检出量最大，8月和5月蓝藻检出量达到最大值，季节性温度变化会影响这两类生物的生长，应该依照不同季节和不同类型的排污口针对性地对蓝藻进行治理，防止造成水体污染。